目的:　　 慢性炎症是人类和小鼠肿瘤主要的致病因素之一。应用非甾体类的抗炎药物(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)可以减少家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)患者的结肠癌发病率。多阶段化学诱导皮肤肿瘤被认为是一种经典的与炎症相关的肿瘤模型。TPA是一种强效皮肤致炎剂，TPA通过反复在小鼠局部涂抹刺激皮肤诱发炎症而对肿瘤发生起决定性作用。在肿瘤促癌阶段，应用地塞米松或非甾体类抗炎药的抗炎治疗，可抑制TPA诱导小鼠皮肤肿瘤的形成。黄芩素是黄芩中主要的黄酮类生物活性成分，众多体内和体外实验证实，黄芩素有抗感染、抗炎的作用，本研究通过建立小鼠多阶段化学诱导皮肤肿瘤模型与短期TPA诱发小鼠炎症的模型，观察黄芩素抑制小鼠肿瘤生长情况，探讨黄芩素抗炎作用与肿瘤抑制的关系。　　 材料与方法:　　 一、实验动物：　　 C57BL/6雌性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，周龄为6-8周，体重20克±1克。　　 二、主要试剂：　　 二甲基苯并蒽(dimethyl benzanthracene，DMBA)、十四烷酰佛波醋酸酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)、黄芩素(baicalein)购于Sigma-Aldrich公司。Ki-67抗体、NF-κB p65抗体、CD68抗体、Neutrophil抗体、COX2抗体购于Abcam公司，S-P免疫组化试剂盒和DAB试剂盒购于中衫金桥生物技术有限公司，TUNEL试剂盒购于Roche公司。　　 三、方法：　　 1、建立肿瘤动物模型：C57BL/6雌性小鼠，周龄为6～8周，体重20克±1克。小鼠麻醉后，背部剃毛，两天后给予DMBA100nmol/200μl丙酮一次。两周后给予TPA：10nmol/200μl丙酮(3次/周，周一，周三，周五)。每次涂药半小时前给予不同浓度组黄芩素和塞来考昔干预，药物溶于200μl丙酮中。阳性对照组(A)：DMBA/TPA+200μl丙酮。黄芩素低浓度组(B)：DMBA/TPA+黄芩素0.05mg/200μl丙酮。黄芩素中浓度组(C)：DMBA/TPA+黄芩素0.2mg/200μl丙酮。黄芩素高浓度组(D)：DMBA/TPA+黄芩素0.5mg/200μl丙酮。塞来考昔组(E)：DMBA/TPA+赛来考昔5mg/200μl丙酮。每周观察各组小鼠皮肤肿瘤出现时间、数量及每个肿瘤直径。　　 2、小鼠炎症模型建立：C57BL/6雌性小鼠，周龄为6-8周，体重20克±1克。小鼠麻醉后，背部剃毛，两天后给予TPA：10nmol/200ul丙酮一次。涂药半小时前给予不同浓度组黄芩素和塞来考昔干预，药物溶于200μ1丙酮中。阳性对照组(A)：TPA+200μl丙酮。黄芩素低浓度组(B)：TPA+黄芩素0.05mg/200μl丙酮。黄芩素中浓度组(C)：TPA+黄芩素0.2mg/200μl丙酮。黄芩素高浓度组(D)：TPA+黄芩素0.5mg/200μl丙酮。塞来考昔组(E)：TPA+赛来考昔5mg/200μl丙酮。空白对照组(N)：200μl丙酮+200μl丙酮。分别在给药后6、12、24、48h取小鼠皮肤组织。空白对照组为0h。每个时间点每组小鼠各6只，　　 3、HE染色、姬姆萨染色及免疫组化检测：标本经石蜡包埋，制成4μm切片。经过脱蜡，脱苯，水化，常规HE染色；免疫组化采用S-P法，检测NF-κBp65、Neutrophil、CD68、Ki-67、COX2表达，PBS作为阴性对照。肿瘤细胞凋亡采用TUNEL法进行细胞凋亡原位检测，按试剂盒说明书进行操作。肥大细胞组织切片采用姬姆萨染色检测。　　 4、结果判定：Ki-67、NF-κB p65及TUNEL法阳性表达位于细胞核，两位有经验的病理科医师阅片，每张切片随机选取5个高倍视野，计数阳性细胞百分比。CD68、Neutrophil及姬姆萨染色分别标记巨噬细胞、中性粒细胞及肥大细胞，每张切片用镜下标尺计数单位面积内阳性细胞数。取两位医师的平均值为最后结果。　　 四、统计学分析：　　 应用SPSS17.0统计分析软件进行数据处理，取P<0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1、在抑制肿瘤生长模型中，黄芩素低、中、高浓度组(B、C、D组)及塞来考昔组(E组)肿瘤出现时间阳性对照组(A组)相比显著延迟(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。肿瘤发生率B、C、D、E组分别为55.6％、66.1%、66.1%、50%，低于A组(100%)。平均每只小鼠肿瘤个数A、B、C、D、E组分别为4.7、0.61、0.72、0.72、0.72，A组与B、C、D、E组相比较有明显差异(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。肿瘤大小比较，A组大于B、C、D、E组，A组肿瘤细胞更具有侵袭性，而B、C、D、E组肿瘤表面角化明显。　　 2、各组肿瘤细胞中Ki-67阳性表达率分别为27.3%、8.3%、8.5%、7.7%、6.9%，A组明显高于其他各组(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。肿瘤细胞NF-κB p65核阳性表达率A、B、C、D、E组分别为21.1%、3.67%、3.3%、4.1%、3.86%，A组明显高于其他各组(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。肿瘤组织中肥大细胞个数分别为1.15、0.23、0.26、0.27、0.21(x103/mm2)，中性粒细胞个数分别为0.52、0.13、0.15、0.15、0.16(x103/mm2)，巨噬细胞个数个数分别为0.51、0.1、0.11、0.08、0.11(x103/mm2)，A组与B、C、D、E组相比较有明显差异(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。肿瘤组织中COX2阳性信号表达E组强于其余各组。　　 3、各组肿瘤细胞中凋亡细胞百分数分别为4.3%、20.7%、18.3%、21.7%、22.3%，A组与B、C、D、E组相比较有明显差异(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。　　 4、短期TPA诱导炎症模型中，A组小鼠背部皮肤上皮小随时间变化而增生，48h表皮细胞增生至4-6层，而B、C、D、E组表皮细胞为2-4层。A组与B、C、D、E组相比有明显差异(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差异。A组皮肤表皮细胞厚度明显大于B、C、D、E组(P<0.01)，而B、C、D、E组之间无明显差别。　　 5、A组随时间变化表皮内单核细胞浸润明显增多。免疫组化及特染显示，各组不同时间真皮内炎细胞细胞计数，A组给药6h后小鼠皮肤肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞增多，12h有进一步增多，24h后A组中各组单核细胞数量达到最多，至48h时细胞数呈下降趋势。与B、C、D、E组各时间点相比有显著差异(肥大细胞，P<0.01；中性粒细胞，P<0.01；巨噬细胞，P<0.01)。B、C、D、E组间无明显差异。　　 结论：　　 1、本研究证实黄芩素可抑制多阶段化学诱导小鼠皮肤肿瘤生长。　　 2、黄芩素能抑制肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡。　　 3、黄芩素可抑制肿瘤间质炎细胞浸润。　　 4、黄芩素具有抑制NF-κB活性的作用。　　 5、黄芩素还能抑制肿瘤促癌阶段TPA引发的炎症反应和表皮增生，证实了黄芩素的抗炎作用在抑制肿瘤的过程中起到了一定作用。