目的：　　前期初步试验发现，体外HupA与HupB以一定的配比组合对HupA抗胆碱酯酶活性具有减毒增效作用。基此，本课题以整体动物为受试对象，就Hup A与Hup B不同配比组合对AChE抑制活性及其安全性进行观察和比较，为探寻作用更强、毒副作用更小的胆碱酯酶抑制剂，进而为开发全天然创新药物制剂提供实验依据。　　方法：　　1.石杉碱甲与不同配比石杉碱乙组合对ChE活性影响的初步观察将ICR小鼠随机分为5组，即空白对照组NS、阳性药hupA对照组、石杉碱甲与石杉碱乙等量配比组合物组Ca(hupA0.8 mg/kg+ hupB0.8 mg/kg)、石杉碱甲与石杉碱乙1∶2配比组合物组Cb(hupA0.8 mg/kg+ hupB1.6 mg/kg)、阳性物hupB对照组;每组各设0.5 h、1h2个时间点，每亚组动物6只;除NS外，其他各组给药剂量分别为0.8 mg/kg、1.6 mg/kg、2.4 mg/kg、0.8 mg/kg，其中hupA组、Ca、Cb二个组合物中hupA成分含量均为0.8 mg/kg;灌胃给药，给药容量均为20 ml/kg。小鼠于给药0.5 h、1h时腹腔注射25％乌拉坦4 ml/kg，麻醉后腹主动脉取血，4℃冷藏柜中静置2h，全血经离心机3500 r/min离心10 min，取上层血清作为血清酶原，置-80℃保存备用，测定时14倍稀释。小鼠去掉脑壳冰上分离出大脑，称重记录脑重后，用冰磷酸盐缓冲液(PH7.0)按3∶10(wt/v)匀浆，脑匀浆经冷冻离心机3500 r/min离心10 min后，分离上清，-80℃保存备用，检测时10倍稀释。　　2.石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合对ChE活性的时效关系考察　　将ICR小鼠随机分为7组，即空白对照组NS、阳性药对照组hupA(hupA∶hupB=1∶0)、不同配比组合物组C1(hupA∶hupB=2∶1)、C2(hupA∶hupB=1∶1)、C3(hupA∶hupB=1∶2)，C4(hupA∶hupB=1∶4)，阳性物对照组hupB(hupA∶hupB=0∶1);每组各设0.25 h、0.5h、1h、2h、4h、8h共6个时间亚组，每亚组动物11只;除NS外，其他各组给药剂量均为0.8 mg/kg;灌胃给药容量均为20 ml/kg。酶原制备:大鼠于给药1h时腹腔注射25％乌拉坦4 ml/kg，鼠去掉脑壳冰上分离出大脑，称重记录脑重后，用冰磷酸盐缓冲液(PH7.0)按3∶10(wt/v)匀浆，脑匀浆经冷冻离心机3500 r/min离心10 min后，分离上清，-80℃保存备用，检测时10倍稀释。　　3.石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合对胆碱酯酶活性的量效关系考察　　将SD大鼠随机分为7组，即空白对照组NS、阳性药对照组hupA(hupA∶hupB=1∶0)、不同配比组合物组C1(hupA∶hupB=2∶1)、C2(hupA∶hupB=1∶1)、C3(hupA∶hupB=1∶2)，C4(hupA∶hupB=1∶4)，阳性物对照组hupB(hupA∶hupB=0∶1);除NS外，其它各组均设3个浓度亚组，即0.48、0.24、0.12 mg/kg，每亚组6只动物;灌胃给药容量均为10 ml/kg。大鼠于给药1h时腹腔注射25％乌拉坦4 ml/kg，麻醉后腹主动脉取血，4℃冷藏柜中静置2h，全血经离心机3500 r/min离心10 min，取上层血清作为血清酶原，置-80℃保存备用，测定时14倍稀释。小鼠去掉脑壳冰上分离出大脑，称重记录脑重后，用冰磷酸盐缓冲液(PH7.0)按3∶10(wt/v)匀浆，脑匀浆经冷冻离心机3500 r/min离心10 min后，分离上清，-80℃保存备用，检测时10倍稀释。　　4.石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合的毒性考察　　ICR小鼠360只，随机分成6批实验，每批5-7组，每组10只，各组动物禁食不禁水12h后，按预试结果分别灌胃给予hupA、C1、C2、C3、C4、hupB，给药后自由饮食，即时及以后每日上、下午观察一次，连续7天，第8日后每日观察一次，记录14天内动物的毒性。　　结果：　　1.石杉碱甲与不同配比石杉碱乙组合对胆碱酯酶活性影响的初步观察　　(1)阳性药hupA以0.8 mg/kg剂量灌胃给药，小鼠大脑AChE活力呈明显的下降(P＜0.05)但对血清BuChE活性抑制作用较弱。　　(2)阳性物hupB以0.8 mg/kg剂量灌胃给药，小鼠大脑AChE活力和血清BuChE活力均呈明显下降(P＜0.05)，其特征:抑制大脑AChE活力强度显著低于hupA(P＜0.05)，抑制血清BuChE活力显著大于hupA(P＜0.05)。　　(3)组合物Ca（hupA0.8 mg/kg+ hupB0.8 mg/kg）和组合物Cb(hupA0.8 mg/kg+hupB1.6 mg/kg)分别灌胃给药，小鼠大脑AChE活力和血清BuChE活力亦均呈明显的下降(P＜0.05)，其特征为抑制大脑AChE和血清BuChE活力强度均大于单用hupA(P＜0.05)。　　2.石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合对胆碱酯酶活性的时效关系考察　　(1) hupA、C1、C2、C3、C4和hupB给药后对小鼠大脑AChE活力呈明显的抑制作用(P＜0.05)，其抑制大脑AChE活力起效和药效持续时间依次为0.25-4 h、0.25-2 h、0.25-4 h、0.25-4 h、0.25-1 h、0.25-0.5 h，抑制率峰值依次为44.9％、46.9％、42.1％、46.0％、53.6％、31.6％，达峰时间依次为1h、0.25 h、0.25 h、1h、1h、0.25 h。其中，C1、C2、C3降低小鼠大脑AChE活力与hupA比无显著差异(P＞0.05);hupA、C1、C2、C3降低小鼠大脑AChE活力与hupB比则差异显著(P＜0.05)。　　(2) hupA、C1、C2、C3、C4和hupB在给药后0.25h～4h期间仅呈非常微弱的抑制血清AChE活性的作用趋势(P＞0.05)。C1、C2、C3、C4降低小鼠血清AChE活性与hupA或hupB比均无显著差异(P＞0.05)。　　(3) hupA、C1、C2、C3、C4和hupB给药后呈现出程度不一的抑制血清BuChE活性的作用(P＜0.05)，其抑制血清BuChE活性起效及药效持续时间依次为0.25h、0.5 h、0.5-1 h、0.5 h、0.25-8 h、0.25-8 h，抑制率峰值依次为14.8％、18.9％、23.3％、17.8％、28.9％、30.7％，达峰时间依次为0.5h、0.5 h、0.5 h、0.5h、0.5 h、0.5 h。与hupA比，除给药2h的C3、给药0.5 h和8h的C4抑制血清BuChE活性明显提高外，其它C1、C2、C3、C4、hupB各时点均无显著差异(P＞0.05)。与hupB比，除给药0.5 h和8h的hupA、C1、给药0.5h的C3抑制血清BuChE活性明显下降外，其它hupA、C1、C2、C3、C4各时点均无显著差异(P＞0.05)。　　3.石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合对胆碱酯酶活性的量效关系考察　　(1)hupA、C1、C2可显著降低大鼠海马AChE活性，呈良好的剂量依赖关系，其最大抑制率依次为47.3％、32.9％、39.9％。其中，高、中、低剂量组C1、C2与同剂量hupA比较，除高剂量组C1外，两者抑制活性均无明显差异(P＞0.05)，而与同剂量hupB比较，C1、C2抑制活性比hupB更强，除中剂量组C1外，差异显著(P＜0.05)。　　(2) hupA、C1、C2、C3、C4、hupB可显著降低大鼠大脑皮层AChE活性，其中hupA、C1、C2、C3呈良好的剂量依赖关系，其最大抑制率依次为54.9％、50.1％、54.0％、43.7％。其中，高、中、低剂量组C1、C2、C3与同剂量hupA比较，除中剂量组C2、低剂量组C3外，其抑制活性均无显著差异(P＞0.05)，其中中剂量组C2的抑制活性还显著低于hupA(P＜0.05);而与同剂量hupB比较，除中剂量组C1外，高、中、低剂量组C1、C2皮层AChE活性均显著降低，AChE抑制活性增强，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　(3)hupA、C1、C2可显著降低大鼠纹状体AChE活性，有一定的剂量依赖关系,其最大抑制率依次为46.7％、33.5％、58.8％。其中，高、中、低剂量组C1、C2与同剂量hupA比较，除中剂量组C2抑制活性显著增强外，两者抑制活性均无显著差异(P＞0.05);而与同剂量hupB比较，高剂量组C1、C2、低剂量组C2的抑制活性比hupB更强，差异显著(P＜0.05)。　　(4) hupA、C1、C2、C3、C4、hupB对大鼠大脑血清AChE活性有一定的抑制作用，无明显的剂量依赖关系，其中hupA、C1、C2最大抑制率依次为36.3％、42.5％、36.1％。与同剂量hupA比较，高剂量组C1、C2、低剂量组C1对大鼠血清AChE的抑制活性比hupA强，差异有统计学意义(P＜0.05);与同剂量hupB比较，除低剂量组C1、C2的抑制活性显著增强(P＜0.05)外，高、中剂量组C1、C2的抑制活性与高、中剂量组hupB比无显著差异(P＞0.05)。　　(5)hupA、C1、C2、C3、C4、hupB对大鼠血清BuChE活性有一定的抑制作用，其最大抑制率依次为71.9％、79.4％、57.7％、30.9％、66.4％、29.2％，无明显的量效关系。与同剂量hupA比较，除高剂量组C1、C4血清BuChE活性较强、低剂量组C1、C4血清BuChE活性较弱(P＜0.05)外，其它各剂量组C1、C2、C3、C4血清BuChE活性与同剂量组hupA比较无显著差异(P＞0.05)。与同剂量hupB比较，除高剂量组C1、C4、低剂量组C2抑制酶活性显著增强(P＜0.05)外，其它各剂量组C1、C2、C3、C4血清BuChE活性与同剂量组hupB比较无显著差异(P＞0.05)。　　4.石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合的毒性考察　　给小鼠一次性灌胃阳性药hupA、组合物C1、C2、C3、C4、阳性物hupB，给药后观察14天，结果hupA、C1、C2、C3、C4的LD50分别为6.39 mg/kg、15.2mg/kg、13.1 mg/kg、23.0 mg/kg、23.0 mg/kg，hupB的最大耐受量为52.8 mg/kg。　　结论：　　经对胆碱酯酶抑制活性的起效时间、药效持续时间、达峰时间以及达峰值等指标进行综合比较分析，C1、C2在石杉碱不同配比组合物中显示出明显的优势，其特点为抗乙酰胆碱酯酶活性强，LD50大，安全系数高。　　以相等石杉碱甲剂量作为药效毒性参比剂量，在相等石杉碱甲剂量下组合物C1、C2与等剂量HupA比，其抑制大脑乙酰胆碱酯酶的活性比单用HupA更强。其特征:(1)组合物C1:抑制海马乙酰胆碱酯酶活性C1＜hupA;抑制皮层、纹状体乙酰胆碱酯酶活性C1＞hupA;(2)组合物C2:抑制海马、皮层、纹状体乙酰胆碱酯酶活性C1＞hupA。　　石杉碱甲与石杉碱乙不同配比组合的成药性分析评价结果显示，组合物C1、C2可作为乙酰胆碱酯酶抑制剂候选药物（中药成分组合物）进行深入开发。其中，以组合物C2优先。