论文部分内容阅读
实验目的通过体外实验,研究二甲双胍对乳腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响；探讨二甲双胍在抗乳腺癌中可能的分子靶点及其相关信号通路,初步证实二甲双胍的抗肿瘤作用。实验方法通过体外培养小鼠乳腺癌4T1细胞,检测不同浓度二甲双胍对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移、侵袭能力的影响；采用免疫印迹试验（WB）技术检测二甲双胍对细胞凋亡蛋白、细胞周期调控蛋白、侵袭相关蛋白表达的影响及探究AMPK/mTOR通路在二甲双胍抑制乳腺癌癌细胞生长现象中的作用。实验结果1.二甲双胍抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖MTT结果显示二甲双胍能够抑制4T1细胞增殖（P<0.05）,且具有浓度依赖性和时间依赖性；Compound C可以拮抗二甲双胍对乳腺癌4T1细胞的增殖抑制作用。2.二甲双胍激活乳腺癌细胞中AMPK/mTOR通路,Compoud C可以减弱其作用。免疫印迹试验（WB）检测发现二甲双胍作用乳腺癌细胞48小时后,细胞内AMPK蛋白磷酸化水平提高,而mTOR通路下游蛋白p70S6K蛋白的磷酸化水平下降,这种作用呈浓度依赖性；而Compound C可以拮抗二甲双胍作用。3.二甲双胍抑制乳腺癌细胞克隆形成二甲双胍能够抑制4T1细胞的克隆形成（P<0.05）,表现出浓度依赖性,5mM的二甲双胍作用时,4T1的克隆形成率仅为4.11%。4.二甲双胍抑制乳腺癌细胞周期进行流式细胞仪检测发现二甲双胍能够抑制乳腺癌细胞从Go/G1期进入S期,从而阻止乳腺癌细胞周期的进行（P<0.05）；免疫印迹试验（WB）检测发现二甲双胍导致乳腺癌细胞中Cyclin D1表达量的降低,说明二甲双胍抑制乳腺癌细胞增殖可能是通过下调Cyclin D1表达、阻止细胞从Go/G1期进入S期从而阻止细胞周期进行来实现。5.二甲双胍诱导乳腺癌细胞凋亡通过Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测、DAPI染色荧光显微镜检测及免疫印迹试验（WB）检测发现二甲双胍能够诱导乳腺癌细胞出现凋亡同乳腺癌细胞在二甲双胍的作用下Cleaved Caspase-3表达量升高,说明二甲双胍能够激活细胞凋亡蛋白Caspase-3,从而诱导乳腺癌细胞发生凋亡（P<0.05）。6.二甲双胍抑制乳腺癌细胞的侵袭及迁移划痕实验发现二甲双胍能够使乳腺癌细胞迁移能力下降；通过Transwell结果发现二甲双胍能够使乳腺癌细胞侵袭能力下降。免疫印迹试验（WB）检测发现二甲双胍导致乳腺癌细胞中侵袭相关蛋白（MPP-2,MPP9）表达量下降。实验结论1.二甲双胍可以抑制乳腺癌4T1细胞的增殖,将4T1细胞阻滞于Go/G1期并诱导细胞凋亡；2.二甲双胍可能通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制乳腺癌4T1细胞的增殖,Compound C可以拮抗二甲双胍对乳腺癌4T1细胞的增殖抑制作用；3.二甲双胍可以降低乳腺癌4T1细胞的迁移能力及侵袭性。实验目的通过建立晚期乳腺癌模型,进一步证实二甲双胍的抗肿瘤作用,并初步探讨其对晚期乳腺癌远处转移的影响,为二甲双胍的抗肿瘤效应提供新的证据,同时给晚期乳腺癌的临床治疗提供新的思路和治疗选择。实验方法建立晚期乳腺癌BALB/C小鼠移植瘤模型,观察二甲双胍治疗对BALB/C小鼠移植瘤生长及肺脏转移的影响。采用免疫组化（IHC--F）方法检测二甲双胍对移植瘤中增殖细胞相关抗原（ki-67）及磷酸化mmTOR表达的影响。采用荧光TUNEL检测移植瘤中细胞凋亡的情况。采用免疫印迹试验（WB）技术检测二甲双胍对移植瘤中AMPK蛋白磷酸化及侵袭相关蛋白表达的影响。采用ELISA法检测荷瘤小鼠血清胰岛素和IGF-1水平。实验结果1.二甲双胍抑制乳腺癌移植瘤的生长。通过游标卡尺及精密天平测量发现在BALB/C小鼠移植瘤模型中,口服二甲双胍治疗后能显著缩小BALB/C小鼠移植瘤体积（P<0.05）。通过免疫组化（IHC-F）检测发现口服二甲双胍治疗后BALB/C小鼠移植瘤组织中的ki-67指数显著降低（P<0.05）,mTOR蛋白磷酸化表达量显著下降。通过荧光TUNEL染色发现口服二甲双胍治疗后BALB/C、鼠移植瘤组织中细胞凋亡数显著增加。2.二甲双胍抑制晚期乳腺癌的远处脏器转移。通过免疫印迹试验（WB）检测发现口服二甲双胍治疗后BALB/C小鼠移植瘤组织中肿瘤侵袭相关蛋白（MPP-2,MPP--9）表达量下降。通过计数BALB/C小鼠移植瘤模型中肺脏转移瘤个数并结合其肺脏HE染色病理切片发现口服二甲双胍治疗后,BALB/C小鼠移植瘤模型中肺脏转移个数显著下降（P<0.05）。实验结论1.二甲双胍能够抑制4T1小鼠模型异位移植瘤的生长,其主要机制可能包括：将4T1细胞阻滞于Go/G1期、诱导细胞凋亡及激活/MPK/mTOR信号通路；2.二甲双胍能够抑制4T1小鼠模型远处脏器转移,其机制可能是抑制了移植瘤组织中侵袭相关蛋白的表达。