论文部分内容阅读
体细胞核移植技术在多年的研究发展中日益完善，但核移植效率仍然较低，限制了体细胞核移植技术的应用。目前普遍认为，核移植效率低主要是由于供体细胞核在卵母细胞中的去分化和重编程不完全。体细胞核移植重构胚常常表现为DNA甲基化水平过高。本研究拟通过探讨新型DNA甲基转移酶抑制剂RG108对水牛成纤维细胞甲基化水平及其核移植重构胚发育的影响，探索一种能提高核移植效率的有效途径。
首先，探讨了不同浓度DNA甲基转移酶抑制剂RG108对水牛成纤维细胞生长特性、染色体倍性、DNA甲基化水平及DNMTs mRNA表达量的影响。第7代水牛成纤维细胞经不同浓度RG108(0，5，10，20，100μmol/L)处理72h后，分别对细胞的生长状态、染色体倍性及甲基化水平等进行检测分析。结果显示：(1)经台盼蓝染色结合细胞计数法检测细胞存活率并绘制细胞生长曲线，发现经不同浓度RG108处理的水牛成纤维细胞生长曲线与对照组(0μmol/L)基本一致，各组间细胞的存活率没有显著下降现象(P>0.05)；(2)细胞常规染色体核型分析发现，不同浓度组(0、5、10、20、100μmol/L)的细胞染色体非整二倍体百分比(10.3％、12.3％、10.3％、12.1％、12.6％)之间差异均不显著(P>0.05)；(3)免疫荧光组化间接检测水牛成纤维细胞5-甲基胞嘧啶的相对含量发现，随着RG108处理浓度的升高，水牛成纤维细胞的荧光相对强度逐渐降低，其中添加20、100μmol/LRG108的两个处理组与对照组差异显著(P<0.05)，但两个处理组(20、100μmol/L)之间差异不显著(P>0.05)；(4)实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测结果显示，浓度为10、20、100μmol/L的RG108都显著下调细胞DNMT1mRNA的表达(P<0.05)，并以20μmol/L组最显著，但RG108对DNMT3amRNA的表达没有显著性影响(P>0.05)。
同时，探讨了RG108处理水牛成纤维供体细胞对水牛体细胞核移植重构胚发育的影响。使用20μmol/L RG108分别处理水牛成纤维供体细胞不同时间(0、24、48、72、96 h)后进行体细胞核移植。结果发现，20μmol/LRG108处理供体细胞72 h可显著提高核移植重构胚的囊胚发育率(P<0.05)，而且其囊胚细胞数与IVF组的囊胚细胞数差异不显著(P>0.05)。
以上结果表明：(1)适宜浓度(≤100μmol/L)的RG108对水牛成纤维细胞的生长特性、存活率及核型没有显著影响；(2)浓度为20μmol/LRG108处理水牛成纤维细胞72h，可显著降低其DNA甲基化水平和DNMT1mRNA的表达，从而提高其核移植重构胚的发育能力，增加重构胚的囊胚细胞数。