【摘 要】
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研究背景:短肠综合征（Short bowel syndrome,SBS）是儿童及成人慢性肠衰竭的主要原因,一旦SBS不能通过治疗获得肠道营养自持性,患者将不可逆地发展为慢性肠衰竭,需要终生的肠外营养支持,这将给家庭及社会造成巨大的经济负担。目前,SBS的治疗手段有肠外营养（Parenteral Nutrition,PN）、肠道整形术、小肠移植和肠康复治疗,但各有局限。在这种治疗的窘境下,针对剩余肠
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研究背景:短肠综合征（Short bowel syndrome,SBS）是儿童及成人慢性肠衰竭的主要原因,一旦SBS不能通过治疗获得肠道营养自持性,患者将不可逆地发展为慢性肠衰竭,需要终生的肠外营养支持,这将给家庭及社会造成巨大的经济负担。目前,SBS的治疗手段有肠外营养（Parenteral Nutrition,PN）、肠道整形术、小肠移植和肠康复治疗,但各有局限。在这种治疗的窘境下,针对剩余肠道的肠康复治疗成为SBS治疗的重点和突破点。胰高血糖素样肽-2（Glucagon-likepeptide-2,GLP-2）是由末端回肠和结肠的L细胞分泌的一种肠道营养性生长因子,是目前SBS肠康复治疗的关键因子。GLP-2能够促进肠粘膜生长,进而促进营养物质的吸收。但研究表明,肠上皮细胞上不表达GLP-2受体,GLP-2可能需要cell-to-cell通讯发挥其生物功能,但具体机制仍存在争议。小肠是人体中增殖最旺盛的器官之一,而近期研究表明小肠干细胞的自我增殖、凋亡等受临近细胞分泌的信号介质调控,这也是一种典型的cell-to-cell通讯。近期大量高水平研究表明,外泌体转运的miRNA是cell-to-cell通讯的重要信号介质,可转录后调控多种病理生理过程中的基因表达。miRNA对小肠干细胞起到重要的调控作用,研究表明小肠特异性缺失Dicer酶可导致miRNA缺失,进而导致严重小肠的结构缺陷和功能紊乱。因此,外泌体转运的miRNA是否可以调控肠上皮细胞的增殖凋亡值得研究;GLP-2是否可以通过外泌体转运的miRNA发挥其生物功能亦具有重要研究价值。因而,本研究旨在对上述的科学问题进行研究探索,并明确外泌体转运的miRNA调控肠上皮细胞增殖和凋亡的机制。研究方法:（1）构建Ⅱ型SBS大鼠模型,检测GLP-2对肠上皮细胞的增殖凋亡和肠适应影响;（2）再次构建SBS大鼠模型或假手术模型,运用超速离心法提取肠组织外泌体,并利用NTA、透射电镜及免疫印迹分析对提取出的肠组织外泌体进行鉴定;（3）运用CCK-8检测、EdU染色、流式细胞术、免疫印迹分析及qPCR等方法在体外实验中检测肠组织外泌体对肠上皮细胞的增殖凋亡的影响;（4）通过对肠组织外泌体进行miRNA测序并结合既往文献,筛选出其中可能参与调控肠上皮细胞增殖和凋亡的miRNA,并通过miRNA功能学实验进行验证;（5）培养特异性表达GLP-2受体的CCD-18Co细胞,检测GLP-2对该细胞的增殖凋亡的调控作用,并验证GLP-2是否可以改变CCD-18Co细胞分泌的外泌体中miRNA的表达量;（6）结合miRNA靶基因的生物信息学预测结果,通过外泌体miRNA功能回复实验、免疫印迹分析、双荧光素酶报告基因实验、Pulldown实验、SiRNA敲减及质粒过表达目的基因等实验对miRNA下游通路进行探讨。结果:（1）GLP-2可显著促进Ⅱ型SBS大鼠的肠适应,促进肠隐窝上皮细胞的增殖,抑制肠绒毛上皮细胞的凋亡;（2）利用Ⅱ型胶原酶的培养基消化及超速离心法提取的肠组织外泌体浓度纯度良好;（3）肠组织外泌体可调控肠上皮细胞的增殖凋亡,GLP2-Exo表现出显著的促增殖和抗凋亡作用;（4）外泌体miRNA测序及qPCR表明,miR-125a/b同升同降的变化趋势,GLP2-Exo中miR-125a/b表达显著降低;并且,miR-125a/b可显著抑制肠上皮细胞增殖并促进肠上皮细胞凋亡;（5）进一步,通过表达GLP-2受体的CCD-18Co细胞,成功提取并鉴定了该细胞分泌的外泌体,并明确了 GLP-2处理可使该细胞分泌的外泌体中miR-125a/b的表达量显著降低;（6）功能回复实验表明,向GLP2-Exo中转入miR-125a/b可逆转GLP2-Exo的促增殖和抗凋亡作用,说明肠组织外泌体通过miR-125a/b调控肠上皮细胞增殖凋亡;（7）生物信息学分析、免疫印迹、Pull down实验、双荧光素酶报告基因实验等表明miR-125a可直接靶向于MCL1基因的mRNA的3’UTR区并抑制后者的翻译;（8）Si敲减及过表达质粒功能检测等实验证明,MCL1蛋白可显著促进肠上皮细胞增殖并抵抗肠上皮细胞凋亡;（9）miRNA功能回复实验证明,miR-125a通过下调MCL1进而调控肠上皮细胞的增殖凋亡。结论:肠组织外泌体转运的miRNA可调控肠上皮细胞的增殖和凋亡,完成cell-to-cell通讯;GLP-2处理可显著下调其靶细胞分泌的外泌体中miR-125a/b的表达量,后者可通过靶向MCL1基因的mRNA的3’UTR区,进而调控肠上皮细胞的增殖凋亡以及SBS的肠适应。
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