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RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)引起的基因沉默现象。DsRNA在Dicer酶的作用下被剪切成小干扰RNA(Smallinterfering RNA,siRNA),siRNA与Argonaute蛋白及伴侣分子形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),随后,特异地沉默与之互补配对的mRNA。近年来研究表明,利用RNAi技术沉默昆虫生长发育过程中重要基因的表达,可以导致昆虫发育畸形或死亡,从而达到杀虫的目的,所以,RNAi极有可能作为一种新的、环境友好型杀虫技术应用于农业害虫防治。但是,随着研究的深入,发现作为主要农业害虫的鳞翅目昆虫,RNAi效率普遍偏低,而且不同基因的RNAi效率也存在明显差异。本论文以鳞翅目昆虫亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)为研究对象,深入研究其RNAi存在的问题,尽可能找到提高RNAi效率的方法,进而更好地指导RNAi技术应用于实际生产。本论文的研究结果如下: 首先,对亚洲玉米螟糜蛋白酶家族的7个基因以及不同功能的12个基因通过饲喂或注射dsRNA的方式进行RNAi试验。结果表明:同一家族基因的RNAi效率存在显著差异,不同功能的基因,RNAi效率也明显不同。同时还发现,给予玉米螟机械损伤,注射生理盐水,注射外源dsEGFP均会引起部分基因的上调,而且外源dsEGFP也能够引起SP基因的下调。这些结果引起了我们对昆虫RNAi机理及不同基因RNAi效率的重新认识。 为了分析不同基因的RNAi效率,我们对亚洲玉米螟五龄幼虫分别注射外源基因EGFP以及内源基因Mlp的dsRNA,处理6小时后取样,并进行转录组测序。结果发现,能够被两种类型的dsRNA共同诱导上调或下调基因分别有160个和44个。这说明dsRNA进入机体后,会引起体内大量非靶标基因发生变化。随后,我们分别挑选50个被dsRNA诱导上调、25个下调以及43不受dsRNA影响的基因,合成各自的dsRNA注射玉米螟5龄幼虫,6小时后检测各自基因被抑制情况。结果表明,能够被任意一种dsRNA诱导下调的基因,也很容易被自身的dsRNA诱导下调;被任意一种dsRNA诱导上调或者对dsRNA没有响应的基因,注射自身的dsRNA后,有些基因能够被抑制,有些基因不仅不能够被抑制,反而表达量上调。该研究结果提醒我们:昆虫中有些基因很难被自身的dsRNA所抑制。同时,这些结果还可以为我们选取有效的RNAi靶标提供参考。 上述被dsRNA诱导上调的基因中,除了参与机体的免疫应激反应外,有些基因很可能参与了昆虫对dsRNA的特异响应,是昆虫RNAi通路相关基因。我们用细菌、真菌、病毒等不同类型微生物诱导处理亚洲玉米螟幼虫,在处理后6小时和12小时,共检测了23个受dsRNA诱导上调基因的变化情况。结果表明,大部分被dsRNA诱导上调的基因,受不同病原菌处理后也能够被诱导上调,这些基因很可能参与了机体对病原菌的免疫应激反应。除此之外,我们还发现了7个只能被dsRNA诱导表达的基因,推测这些基因很可能与昆虫的RNAi通路密切相关,这7个基因中包括已知的RNAi通路关键基因Ago-2和Dicer-2。本研究结果为我们提供了5个新的昆虫RNAi通路相关基因,有助于我们进一步了解鳞翅目昆虫的RNAi通路及其作用机理,探索提高鳞翅目昆虫RNAi效率的途径。 对另外5个新发现的仅受dsRNA诱导表达的基因进行分析,发现其中的up56基因在dsRNA处理后,呈现异常高的诱导表达倍数。通过对该基因序列以及系统进化分析发现,该基因能够编码PIN结构域的蛋白,并且仅在鳞翅目昆虫中特异表达。同时,up56能够与已知RNAi通路基因Ago-2、Dicer-2在基因表达水平上互相影响。抑制up56基因的表达,能够显著提高玉米螟RNAi效率。对该基因组织表达情况进行分析发现,up56主要存在于中肠。同时发现,中肠粗提物对于不同类型核酸的消化剪切效率与up56的表达量呈正相关。小RNA测序结果表明,up56基因的表达量能够影响由dsRNA剪切而成的small RNA的种类和个数。对up56基因诱导及抑制后的玉米螟中肠以及脂肪体进行转录组测序分析,结果发现,抑制up56基因的表达,中肠大量核酸酶、蛋白酶基因被明显地抑制,而蛋白酶抑制剂基因的表达量则显著提高。这些大量被抑制的核酸酶,很有可能与up56一起,通过降低机体对于dsRNA的无义剪切,提高有效siRNA的富集,进而提高RNAi效率。在这些变化的基因中,发现2个核酸外切酶(exonuclease,exosome complex exonuclease PPR44)以及1个解旋酶(helicaseMOV10)与up56具有相似的表达模式,能够随着up56的上调而上调,下调而下调,并且与up56一样,只能被dsRNA诱导表达,这些基因很有可能与up56相互作用,行使功能,对鳞翅目昆虫RNAi效率产生影响。