木榄细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白BgSOS1的功能研究

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SOS1是一个重要的植物盐胁迫决定因子,SOS1负责Na+/H+反向运输,是至今发现的细胞膜上唯一能把Na+从细胞内运输到细胞外的蛋白质,在盐胁迫时能够把植物细胞内多余的Na+排出体外,所以它与植物耐盐性的关系最直接。木榄是一种,盐生植物,具有很强的耐盐能力,其生长环境的海水盐度可高达3.0%-3.2%,比海水的平均盐度还高。木榄没有盐腺,但根部能把吸收到体内99%的盐分再排出体外,这说明其质膜上的Na+外向运输蛋白具有很强的活性,是研究植物SOS1蛋白生物学功能的绝好材料。主要研究结果如下:1)根据木榄BgSOS1的序列信息从木榄中克隆到了全长的BgSOS1基因。该片段包含一个3462bp的开放阅读框,可编码1153个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果表明:该氨基酸序列与拟南芥、番匣、水稻、小麦、盐芥和杨树的SOS1蛋白高度同源,同源性分别为63.86%、66.61%、62.18%、60.19%、63.97%和75.97%。BgSOS1蛋白的N端含有12个跨膜的结构域、C端为一个较长的胞内结构域。构建BgSOS1-GFP的融合蛋白基因的酵母表达载体,共聚焦显微镜观察发现在转基因酵母定位在细胞膜上。这些都表明BgSOS1可能是分布在细胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白。2) SOS (Salt Overly Sensitive)信号途径是盐胁迫的主要调控途径之一。SOS调控途径中涉及到三个基因:SOS1、SOS2、SOS3.尽管单个BgSOS1表达并不能提高转基因酵母的抗盐性,但BgSOS1、AtSOS2和AtSOS3共表达酵母的抗盐性明显提高,表明SOS2/SOS3蛋白激酶复合体可能通过调控BgSOS1的Na+/H+交换功能提高木榄的抗盐机理。同时发现AtSOS2蛋白激酶在转基因酵母中也可以激活BgSOS1的活性,增强转基因酵母的耐盐性。3)通过设计引物用PCR扩增方法获得Ser1143和Ser1145双突变的BgSOS1突变基因BgSOS1-M,并构建插入该突变基因的酵母表达载体,转化酵母盐敏感突变体菌株AXT3K。酵母互补实验显示,无论单独的AtSOS2蛋白或者SOS2/SOS3蛋白激酶复合体都能调控木榄BgSOS1的活性。4)研究表明SOS1蛋白含有自身功能抑制区,在正常情况下,SOS1常处于休眠状态,活性很低。BgSOS1基因与拟南芥SOS1同源性很高,并且单个BgSOS1也没有明显提高转基因酵母的抗盐性,说明BgSOS1的C端也可能存在一个活性抑制区域,其活性受其自身抑制区。针对这种问题,本实验通过对BgSOS1可能的自身功能抑制区域进行缺失突变,在酵母中进行功能互补试验,比较野生型BgSOS1和其突变基因对转基因酵母抗盐性的影响,发现自身功能抑制区域修饰突变基因BgSOS1-3000能显著提高转基因酵母的抗盐性,在盐胁迫条件下,甚至转BgSOS1-3000的酵母生长的比BgSOS1、AtSOS2和AtSOS3三个基因共转化的酵母都好。说明BgSOS1-3000有很强的抗盐性,可能具有一定的经济价值。5)构建植物表达载体pCAMBIA1302-BgSOS1和pCAMBIA1302-BgSOS1-3000,重组质粒分别导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转基因的工程菌LBA4404-pCAMBIA1302-BgSOS1和LBA4404-pCAMBIA1302-BgSOS1-3000。为研究BgSOS1和其超活性突变基因在作物方面的应用奠定了基础。
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