论文部分内容阅读
目的： 研究广谱抗生素、化疗药物及外源真菌对ICR小鼠肠黏膜机械屏障、生物屏障和免疫屏障的影响作用。 方法： 1.实验处理:64只6周龄ICR雌性小鼠随机分为8组，每组8只。分组设置为A组:无处理对照组;B组:单纯使用广谱抗生素溶液组（1mg/ml盐酸万古霉素、1mg/ml盐酸克林霉素和0.2mg/ml硫酸庆大霉素混合溶液，口服;共18天）;C组:单纯使用化疗药物组（实验第8天时，200mg/kg5-氟尿嘧啶，尾静脉注射，一次）;D组:单纯白色念珠菌灌胃组（实验第9、10两天分别给予1×109/ml白色念珠菌悬液灌胃0.3ml，共两次）;E组:使用抗生素及化疗药物组（抗生素使用同B组，化疗药物使用同C组）;F组:使用抗生素并白色念珠菌灌胃组（抗生素使用同B组，白色念珠菌灌胃同D组）;G组:使用化疗药物并白色念珠菌灌胃组（化疗药物使用同C组，白色念珠菌灌胃同D组）;H组:使用抗生素及化疗药物并白色念珠菌灌胃组（抗生素使用同B组，化疗药物使用同C组，白色念珠菌灌胃同D组）。 2.观测指标:在处理过程中收集各组小鼠不同阶段的粪便颗粒进行涂片革兰染色观察菌群大致结构;并对给予白色念珠菌灌胃组小鼠（D、F、G、H组）的粪便进行白色念珠菌培养计数，研究四组小鼠肠道内白色念珠菌含量的变化。记录小鼠在0天（开始阶段）、7天（抗生素饮用处理后）、10天（白色念珠茵灌胃处理后）和18天（处死前）的体重，并全程记录不同组小鼠死亡情况;在实验第18天时处死全部组小鼠，分别对各组小鼠肺、肝、肾进行研磨匀浆，对匀浆中主要细菌和白色念珠菌进行菌落培养计数，比较各组小鼠细菌和真菌感染率;对脏器切片行苏木精—伊红染色法(HE)染色，观察感染组小鼠各脏器的病理变化;采集处死后各组小鼠盲肠粪便，提取粪便全基因组DNA，利用qPCR法对肠道中总细菌、肠杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、总真菌含量进行定量并对B/E值进行比较分析;采集处死时小鼠外周血，ELISA法检测血清中主要细胞因子水平(IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ)，并研究其在不同组别之间的差异。 结果： 1.实验第7天时，各组小鼠体重均有所增加;第10天时E组和H组小鼠体重有较为明显的下降，其他组小鼠体重变化不大;第18天时E组、G组和H组体重最低，并有不同数量的小鼠死亡，其中H组小鼠的生存率最低，为50％。 2.给予广谱抗生素处理的B、E、F、H组在第7天时，粪便菌群数量和多样性较对照组明显减少，仅有少量的革兰阴性杆菌/球菌，革兰阳性菌少见或未见。单独给予化疗处理的C组小鼠粪便菌群无明显改变;而给予抗生素及化疗处理的E组小鼠粪便涂片显示在革兰阳性杆菌数量明显减少的同时，出现革兰阳性球菌增多的现象。 3.给予白色念珠菌灌胃处理的D、F、G、H组粪便菌群在白念灌胃后第2天开始出现大量酵母菌，部分酵母菌呈现菌丝型。灌胃3-7天以后各组小鼠粪便中白色念珠菌数量呈现逐渐减少的趋势，但H组小鼠在灌胃后的几天粪便中仍维持较高载量(250.5×104 CFU/ml)的白色念珠菌。 4.E组、G组和H组脏器培养结果显示小鼠发生了肠源性脏器细菌感染，多数脏器细菌载量均达到104CFU/g数量级以上。而H组小鼠脏器同时有真菌感染，白色念珠菌载量介于103～104CFU/g之间。 5.小鼠脏器病理切片HE染色显示:感染组小鼠（E、G、H组）脏器均出现了一定程度的病理改变:肺间质大量炎症细胞浸润，肺泡体积被挤压变小;肝细胞水肿气球样变，肝窦受压变窄，肝中央静脉血流发现白色念珠菌胞体;肾小球体积变大，毛细血管腔狭窄甚至闭塞，肾血管内也有白色念珠菌胞体可见;大肠和盲肠均出现明显的肠黏膜细胞脱落坏死，肠黏膜间隙变大，杯状细胞减少，黏膜肌层变薄等黏膜损伤表现。 6.总细菌:对照组（A组）小鼠肠道内总细菌量丰富，抗生素单用或联用组肠道总细菌量下降较为显著，其中三因素联用组（H组）肠道总细菌量最低，与对照组有极显著性差异。肠杆菌属:对照组小鼠肠道肠杆菌属含量处于较低水平，抗生素单用或联用组肠道肠杆菌属含量明显增加，而单因素处理的两组（C、D组）以及联用组（F、G组）肠杆菌属含量则变化不大。双歧杆菌属:抗生素单用或联用组肠道双歧杆菌属数量有所下降，与对照组有统计学差异。肠球菌属:B-G组小鼠肠道肠球菌数量未见显著性改变，仅H组小鼠肠道出现较大幅度的增加。总真菌:单独接受白色念珠菌灌胃的D组小鼠第18天时肠道总真菌量与对照组无差异，提示白色念珠菌在该组小鼠胃肠道中出现了“一过性”现象，而H组小鼠总真菌数量大幅增加，与对照组有较显著性差异。B/E值:对照组小鼠B/E值平均值达到1.344，肠道定植抗力良好，而抗生素处理组别则下降明显。 7.与对照组相比，除接受化疗处理的C组IL-17水平下降明显外，单独抗生素处理（B组）或白色念珠菌灌胃处理组（D组）小鼠血清五种细胞因子水平均无显著性变化;接受化疗联用的G组和H组细胞因子水平均出现不同程度的下降，而未接受化疗处理的F组主要表现为炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ水平的大幅度增高。 结论： 1.抗生素使用不当造成肠道菌群失衡从而破坏肠道微生物屏障; 2.化疗药物对宿主的免疫系统造成破坏，损伤肠黏膜从而破坏肠道的免疫屏障和机械屏障; 3.在肠黏膜屏障被破坏的基础上，外源机会性病原菌的输入导致其在肠道定植进而引起肠源性感染; 4.单因素不足以造成肠源性感染，各因素间的相互作用增加了肠源性感染发生的可能。