多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是浆细胞异常增生的恶性血液病,骨髓内有异常浆细胞增殖,引起骨骼破坏,血清出现单克隆免疫球蛋白,最后导致贫血和肾功能损害。虽经联合化疗、大剂量化疗等取得一定疗效,但最终都不可避免产生耐药。目前,多发性骨髓瘤仍然是不可治愈的疾病。氟达拉滨(Fludarabine)是腺嘌呤核苷酸类似物,其代谢产物(F-ara-ATP)主要通过抑制核糖核酸还原酶、DNA聚合酶、DNA引物酶和DNA连接酶的活性从而抑制DNA的合成,在一些细胞株,还可以通过与RNA结合而抑制转录。氟达拉滨目前已应用于血液系统恶性肿瘤,但氟达拉滨对多发性骨髓瘤的作用及其机制的报道很少,本实验从体内和体外两个方面研究氟达拉滨对多发性骨髓瘤细胞的影响,并试图从多个方面来探讨其作用机制。首先采用MTT比色法检测,结果显示:经不同实验浓度的氟达拉滨处理24、48h后,RPMI8226细胞的增殖在24h时抑制很明显,其半数抑制浓度(IC50)是2.129μg/ml,MM.1S和MM.1R 48h的IC50分别是13.48μg/ml、33.79μg/ml,而U266对氟达拉滨耐药。IL-6及其信号途径是骨髓瘤细胞生长和耐药的主要机制,我们研究了体外IL-6对氟达拉滨诱导细胞凋亡的影响,结果显示:外源性IL-6(50ng/ml)不能阻断氟达拉滨诱导RPMI8226细胞的凋亡。同时我们又联用了氟达拉滨和地塞米松,结果显示氟达拉滨可明显提高地塞米松对MM.1S的细胞毒作用。为探讨氟达拉滨对MM细胞株抑制作用的机制,我们从细胞凋亡及细胞信号传导途径二个层面作了进一步的研究。为了对细胞抑制现象进行准确地定性或定量分析,我们采用流式细胞分析技术研究了磷脂酰丝氨酸(PS)转位、细胞亚G1峰、细胞周期改变,还通过TUNEL法来研究细胞的晚期凋亡。PI染色流式细胞仪分析结果显示:2μg/ml氟达拉滨作用于RPMI8226细胞6,12,24小时,出现G0/G1期的捕获,S期细胞的减少,同时亚二倍体凋亡细胞百分数分别为8.84%,17.05%,26.88%,明显高于空白对照1.63%,说明氟达拉滨对RPMI8226细胞增殖的抑制不仅与细胞周期捕获有关,还与细胞凋亡有关。我们进一步用AnnexinV-PI双标记法流式细胞仪分析,结果显示:RPMI8226细胞经1-4μg/ml氟达拉滨作用24h,药物处理组的凋亡细胞百分数分别为8.84%,12.25%,21.71%,63.28%,65.94%,明显高于空白对照组4.13%。TUNEL结果也显示:随着氟达拉滨作用时间的延长,TUNEL阳性细胞率明显增加,呈时间依赖性。为探讨氟达拉滨诱导细胞凋亡的可能途径,用Western-blot检测氟达拉滨对RPMI8226细胞caspase-8,-9,-7,-3和PARP蛋白的活性变化。结果显示:2μg/ml氟达拉滨作用于细胞6h、12h、24h,可见明显的caspase-8,-9,-7,-3和PARP蛋白的激活带。我们进一步研究了内源性途径在氟达拉滨诱导RPMI8226细胞凋亡的作用,结果显示:随着药物作用时间的延长,线粒体膜电位明显下降,胞浆内Smac蛋白明显上升,bid蛋白明显下降,bax蛋白明显上升。本实验还通过Western-blot检测氟达拉滨对MM细胞株Akt、IAPs蛋白表达的影响。结果显示:2μg/ml氟达拉滨作用于RPMI8226细胞6h、12h、24h,可见Survivin、XIAP蛋白的表达明显下降,而cIAP蛋白的表达没有明显的变化。2μh/ml氟达拉滨作用于四种MM细胞株24h,Survivin表达在RPMI8226、MM.1R、MM.1S中都有不同程度的下降,而在U266细胞中的表达没有变化。我们进一步研究了磷酸化Akt(p-Akt)在MM细胞株中的表达,结果表明:RPMI8226,MM.1S,MM.1R细胞的p-Akt表达较高,表达最低的是U266。2μg/ml氟达拉滨作用于四种MM细胞株24h,仅部分细胞的p-Akt表达下降。我们进一步评价了Akt在氟达拉滨诱导MM细胞凋亡中的作用,在p-Akt表达高的细胞,Akt抑制剂LY294002可诱导明显的细胞凋亡,同时与氟达拉滨联用有轻微的协同作用。为了进一步证实氟达拉滨对MM的抗肿瘤作用,我们用氟达拉滨治疗RPMI8226植入肿瘤小鼠模型。动物实验显示:在荷瘤动物,氟达拉滨能使肿瘤显著缩小,与对照组相比,有显著差异。免疫组化结果显示:氟达拉滨的抗骨髓瘤作用与其诱导细胞凋亡有关。小结:(1)氟达拉滨可直接抑制RPMI8226、MM.1R、MM.1S细胞,并呈浓度依赖性,这种抑制作用不能被IL-6所阻断。(2)氟达拉滨可明显提高地塞米松对MM.1S的细胞毒作用。(3)氟达拉滨处理一定时间后可明显地诱导RPMI8226细胞凋亡,呈浓度时间依赖性。(4)氟达拉滨诱导MM细胞凋亡机理:①内源性和外源性caspase途径激活,具体表现为caspase-8,-9,-7,-3和PARP蛋白的激活;②bid蛋白明显下降,bax蛋白明显上升,胞浆内Smac蛋白明显上升;③Survivin蛋白的表达明显下调;④p-Akt蛋白表达的明显下调。(5)氟达拉滨在动物体内有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,对骨髓瘤荷瘤小鼠有明显的抗肿瘤作用。(6)体内外实验说明氟达拉滨可能成为治疗多发性骨髓瘤的一种新的选择。