纳米纤维由于极高比表面积,且具有极强的与其他物质的互相渗透力,并能够有效地模仿细胞外基质,为细胞提供良好的三维生长空间,有利于细胞的粘附和增殖,多数细胞易于黏附在直径远小于其自身的纳米纤维表面生长,此外,纳米纤维具有良好的可降解性和生物相容性,因此在药物控释载体、临床修复和生物组织工程支架等方面有着巨大的应用市场。本论文的目的是采用左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid,PLLA）纳米纤维这种纳米生物材料作为基底材料培养PC12细胞,观察PC12细胞形态、细胞活力和代谢水平变化,并借助课题组前期得到的代谢组学和转录组学、蛋白质组学数据,首先进行代谢组学分析并进行代谢物表达水平和代谢通路的实验验证;接着进一步进行代谢组学和转录组学、蛋白质组学的联合分析,从分子层面分析PLLA纳米纤维对PC12细胞的影响,并验证重要基因、蛋白质水平变化,从而建立定向纳米纤维表面→细胞粘附→整联蛋白→基因/蛋白质/代谢物变化→细胞分化的途径,在分子层面探究PLLA纳米纤维促进PC12细胞分化的作用机理。本论文主要工作内容:1.制备PLLA纳米材料:采用匀胶法制备PLLA纳米薄膜,采用静电纺丝技术制备左旋聚乳酸定向/不定纳米纤维。通过扫描电子显微镜对此三种材料进行表征,发现PLLA纳米薄膜表面基本平整光滑,PLLA纳米纤维粗细均匀无串珠,定向纳米纤维具有一定的取向性。2.将预分化后的PC12细胞分别种植到PLLA纳米薄膜、不定向/定向纳米纤维材料表面,分别培养12h、24h、36h后,进行细胞形态观察、细胞活力测定和细胞代谢水平检测。通过扫描电镜观察实验和高内涵分析实验确定PC12细胞会沿着纳米纤维的方向伸展,PC12细胞突起伸展方向与定向纳米纤维的取向基本一致,定向纳米纤维能够促进PC12细胞分化过程中细胞突起的延伸程度。细胞活力测定和代谢水平测定实验显示随着作用时间的增加,纳米材料表面的PC12细胞分化程度增加,佐证PLLA定向纳米纤维更能促进PC12细胞的分化。3.利用在线代谢组学分析软件Met PA分析代谢组学差异代谢物数据,获得与神经细胞分化相关的重要代谢物通路和关键代谢通路。PLLA不定向纳米纤维作用PC12细胞过程中,关键代谢通路苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代谢通路涉及的苯丙氨酸主要转化为苯丙酮酸、2-苯乙酰胺,苯丙酮酸和2-苯乙酰胺的合成物苯乙胺的过量累积可能不利于PC12细胞的生长分化。PLLA定向纳米纤维作用PC12细胞过程中,关键代谢通路苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代谢通路中的苯丙氨酸可能主要通过转化为酪氨酸,促进多巴胺和去甲变肾上腺素神经递质的生物合成,为细胞的生长提供能量。这些不同的差异表达变化代谢物通过对应的代谢通路发挥作用,使得在细胞水平上有利于PC12细胞在PLLA定向纳米纤维材料表面生长分化。4.利用生物信息学方法对PLLA纳米纤维作用PC12细胞24h的m RNA表达谱芯片、蛋白质组学、代谢组学数据进行全面系统的多组学联合分析,获得不定向纳米纤维组和定向纳米纤维组的差异表达基因、蛋白质、代谢物共同参与的代谢通路。通过分析讨论重要代谢通路中基因、蛋白质、代谢物的上下游作用关系,获得PLLA不定向纳米纤维影响PC12细胞分化多组学联合分析的关键代谢通路谷胱甘肽代谢、不饱和脂肪酸生物合成和甘油磷脂代谢通路,PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化多组学联合分析的关键代谢通路定向纳米纤维组关键代谢通路为谷胱甘肽代谢、不饱和脂肪酸生物合成和鞘脂类代谢通路。从系统生物学角度发现各通路中的差异表达基因、蛋白质和代谢物相互影响,最终促进PC12细胞的分化。5.根据生物信息学分析结果,通过q RT-PCR和Western Blot方法检测重要基因和蛋白质在PLLA纳米纤维尤其是定向纳米纤维影响PC12细胞分化过程中的作用。PC12细胞分化程度指标的基因GAP43表达水平上调。与整联蛋白相关的基因Itga3、Itga5、Itga7、Itgb4以及Tln1、Map2k5、Mapk6基因表达水平证明PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化与整联蛋白介导的FAK-MEK-ERK通路激活相关。基因Pafah1b1,Daam1,Slit2、Ascl1表达水平验证了其在PLLA定向纳米更能促进PC12细胞分化的作用中发挥着重要作用。本章验证了PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化时,整联蛋白介导的FAK-MEK-ERK通路被激活,磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）进入细胞核改变神经系统发育和神经轴突生长等重要生理功能中发挥重要作用的基因Pafah1b1,Daam1,Slit2和Ascl1的转录等生物化学反应。