研究背景:众多病原微生物是通过黏膜途径感染人体的,主要是经由人体的一些腔道如呼吸道、消化道以及生殖道。相对于系统免疫应答而言,在人体的第一道防线,即黏膜部位诱导机体产生保护性免疫应答尤其重要。大多数传统疫苗通过注射途径免疫不能诱导产生较强的黏膜免疫应答,而黏膜途径免疫可以激发较强的黏膜免疫反应。黏膜疫苗和传统注射接种疫苗一样,也可诱导系统性免疫的产生。黏膜疫苗接种途径多样,有口服接种、鼻内接种、口腔接种等等。其中鼻内接种具有诸多优势:由于鼻粘膜具有丰富的毛细血管和淋巴管,其表面积相对较大,有利于疫苗抗原成分的摄取;操作简单,可自行接种;能克服口服接种后抗原易被消化道降解的不足。虽然经鼻接种有上述优势,但是鼻内疫苗的开发目前仍是困难重重。由于人体的鼻黏膜表面具有多重天然的防御屏障,给疫苗递送造成很大阻碍,因此鼻内疫苗通常需要合适的递送系统来提高抗原的递送效率,减少抗原在鼻黏膜部位的降解与清除,从而增强疫苗的免疫保护效果。纳米乳（Nanoemulsion,NE）是一种热动学稳定的油水分散体系,可以运载疫苗成分递送于黏膜表面。根据制备工艺和材料的不同,NE的颗粒尺寸可以介于20至200纳米间,与病原体颗粒的尺寸接近,可以迅速被黏膜表面的细胞摄取并递送至抗原递呈细胞（APCs）。我们前期的研究发现,以20-50nm左右的NE作为蛋白抗原的载体,通过鼻内接种可以显著增强抗原的黏膜免疫应答,同时促进Th1及Th17免疫应答。T细胞受体（TCR）所识别的表位主要是抗原经APCs加工递呈的肽段,CD4⁺T细胞被其表位肽激活后可分化为不同的辅助性T细胞（Th）,CD8⁺T细胞被其表位肽激活后形成细胞毒性T细胞（CTL）。目前大多数疫苗主要是通过诱导机体产生特异性抗体来发挥抵御微生物感染的作用,然而一些针对病毒、胞内感染细菌以及肿瘤的研究显示,免疫优势的T细胞在宿主获得性免疫中发挥更为重要的保护作用。我们前期的研究也发现,用幽门螺杆菌HpaA蛋白的CD4⁺T细胞表位肽HpaA_154-171（P22）对小鼠进行鼻内接种免疫具有良好的保护效果,能够有效降低小鼠胃部的细菌定植量。由此说明聚焦一些保护性T细胞表位可能是预防或治疗感染及肿瘤的关键。研究目的:为了克服T细胞表位肽分子量小、免疫原性弱、易受机体清除等不足,本课题分别以幽门螺杆菌HpaA蛋白CD4⁺T细胞表位肽(HpaA_154-171,P22)及卵清蛋白（OVA）CD8⁺T细胞表位肽(OVA_257-264,OEP)为免疫原,以纳米乳为载体,制备T细胞表位肽纳米乳疫苗,并开展了其鼻内接种的免疫生物学效应及机制研究,为研制新型T细胞表位肽粘膜疫苗提供技术及理论支撑。研究方法:1.幽门螺杆菌HpaA CD4⁺T细胞表位肽纳米乳疫苗（NE-P22纳米乳疫苗）设计、制备及表征研究（1）NE-P22纳米乳疫苗制剂处方研究方法在课题组前期工作基础上,采用肉豆蔻酸异丙酯（IPM）为油相、EL-35为表面活性剂、丙二醇为助表面活性剂的水包油型纳米乳体系,以粒径范围在20-50nm、Zeta电位范围在-30至30mV、包封率>80%为判断标准,通过不同表面活性剂与助表面活性剂比例（Smix）及P22载药浓度的多因素匹配筛选,确定P22表位肽疫苗（NE-P22）的最佳处方。（2）NE-P22纳米乳疫苗制剂表征鉴定方法分别使用动态光散射粒径电位分析仪、透射电镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、MALDI-TOF MS质谱及CCK8法检测NE-P22的粒径、Zeta电位、分散性、形态学、P22表位肽在递送系统中的稳定性、对BEAS-2B细胞及小鼠BMDC细胞毒性等特征。2.NE-P22纳米乳疫苗的鼻内免疫保护评价及机制研究（1）NE-P22疫苗鼻内接种免疫保护效果评价方法用NE-P22在0、7、14、21天4次鼻内接种免疫小鼠,末次免疫7天后对小鼠进行幽门螺杆菌灌胃感染,30天后检测其胃部幽门螺杆菌定植量,并对胃组织进行病理炎症评分,评价NE-P22鼻内接种免疫的保护效果。（2）NE-P22疫苗鼻内接种免疫保护机制研究方法分别使用共聚焦显微镜、流式细胞术、IVIS小动物活体成像系统、ELISA、ELISPOT检测NE-P22的BEAS-2B细胞摄取效率、诱导BMDC成熟能力、小鼠鼻内滞留时间、鼻粘膜组织摄取效果、抗体水平、细胞因子水平、脾细胞中P22特异性的分泌IFN-γ细胞比例等指标。3.IKVAV-PA偶联OVA_257–264 CD8⁺T细胞表位肽纳米疫苗（NE-IO/MPLA疫苗）设计、制备及表征研究（1）NE-IO/MPLA纳米乳疫苗制剂处方研究方法在课题组前期工作基础上,采用角鲨烯为油相、Tween-80为表面活性剂的水包油型纳米乳体系,以粒径范围在20-50nm、Zeta电位在-30至30mV间、包封率>80%为标准,通过对IKVAV-PA偶联OVA_257–264（IO）表位肽载药浓度的筛选,确定IKVAV-PA偶联OVA_257–264 CD8⁺T细胞表位肽纳米乳鼻内疫苗（NE-IO/MPLA）的最佳处方。（2）NE-IO/MPLA纳米乳疫苗制剂表征鉴定方法分别使用动态光散射粒径电位分析仪、透射电镜、原子力显微镜及CCK8法检测NE-P22粒径大小、Zeta电位、分散性、形态学特征、黏蛋白存在下的稳定性、对BEAS-2B细胞的毒性等特征。4.NE-IO/MPLA纳米乳疫苗鼻内接种免疫保护评价及机制研究（1）NE-IO/MPLA疫苗鼻内接种免疫保护效果评价方法建立C57BL/6小鼠皮下E.G7细胞荷瘤模型,分别在植瘤前后使用NE-IO/MPLA鼻内接种免疫小鼠,根据肿瘤体积及小鼠生存率评价其预防性及治疗性保护效果。（2）NE-IO/MPLA疫苗鼻内接种免疫保护机制研究方法分别使用共聚焦显微镜、流式细胞术、ELISA、Bio-Plex液相悬浮芯片、T-Select H-2Kb OVA四聚体及体外CTL试验检测NE-IO/MPLA的BEAS-2B细胞摄取、整合素阻断对BEAS-2B细胞摄取率的影响、血清抗体水平、Th1及Th2型细胞因子水平、OEP特异性CD8⁺T细胞的比例及体外CTL清除E.G7效果等指标。研究结果:1.幽门螺杆菌HpaA CD4⁺T细胞表位肽的纳米乳鼻内递送系统设计、制备及表征研究优选出以Smix=4:1,载药浓度为1000μg/mL的处方,成功制备NE-P22鼻内疫苗,其平均粒径为22.84±0.01nm,Zeta电位为-5.168±1.687mV,PDI为0.1830±0.0026,包封率为96.13±0.81,分散性较好。通过TEM及AFM观察发现,NE-P22疫苗颗粒大小在20-30nm左右,呈表面光滑球状,无明显聚集。MALDI-TOF MS检测证实P22表位肽在NE-P22中稳定。此外,NE-P22稀释20倍后对BEAS-2B细胞及小鼠BMDC细胞无明显毒性作用。2.幽门螺杆菌HpaA CD4⁺T细胞表位肽的纳米乳鼻内递送系统的免疫保护评价及机制研究NE-P22鼻内接种免疫小鼠能显著降低幽门螺杆菌感染后胃部的定植量（P<0.05）以及炎症评分（P<0.01）,显著增强了P22表位肽的免疫保护作用。NE-P22能增加BEAS-2B细胞对P22表位肽的摄取（P<0.01）并能促进DC细胞的成熟（P<0.05）,延长P22表位肽在小鼠鼻腔内的滞留时间（P<0.05）,提高鼻黏膜上皮及鼻黏膜中DC细胞对P22表位肽的摄取率（P<0.001）。NE-P22免疫后不产生特异性的Th2型免疫应答,但可以显著增强P22特异性的Th1型免疫应答,同时这种增强作用与CpG存在协同作用。3.IKVAV-PA偶联OVA_257–264 CD8⁺T细胞表位肽的纳米乳鼻内递送系统设计、制备及表征研究研究发现,IO载药浓度为4mg/mL时制备的纳米乳疫苗粒径最小,平均粒径为22.61±0.71nm,Zeta电位为-16.67±1.76mV,包封率为84.07±7.59%,分散性较好,并且黏蛋白存在时其粒径及Zeta电位均未发生明显变化。通过透射电镜与原子力显微镜观察发现,NE-IO/MPLA疫苗颗粒呈表面光滑球形,大小均匀、分散性良好,无明显聚集。此外,NE-IO/MPLA稀释20倍后对BEAS-2B细胞无明显毒性作用。4.IKVAV-PA偶联OVA_257–264 CD8⁺T细胞表位肽的纳米乳鼻内递送系统免疫保护评价及机制研究对E.G7荷瘤小鼠,NE-IO/MPLA免疫能发挥有效的预防性及治疗性保护效果,可有效抑制肿瘤的生长并延长小鼠的生存时间。NE-IO/MPLA能够促进BEAS-2B细胞对表位肽的摄取（P<0.001）,且整合素阻断后其摄取率显著降低（P<0.01）。NE-IO/MPLA免疫后小鼠血清中无特异性抗体产生,其脾细胞经OEP刺激后Th2型细胞因子水平无明显变化,但Th1型细胞因子水平显著升高,且特异性CD8⁺T细胞比例显著增高（P<0.01）,体外CTL试验证实免疫后诱导产生的CTL能够对E.G7细胞进行有效地杀伤及清除（P<0.001）。研究结论:1.成功制备NE-P22及NE-IO/MPLA两种T细胞表位肽的纳米乳鼻内疫苗,这两种疫苗均具有良好的质量特征。2.这两种疫苗均能有效地增强相应的免疫保护效果,表明纳米乳适合作为T细胞表位肽的鼻内疫苗载体,是一种有效的递送系统设计策略。3.纳米乳能有效促进鼻黏膜对抗原的摄取,延长抗原在黏膜部位的滞留时间,同时促进APCs对抗原的递呈。4.这两种纳米乳载体均表现出一定的佐剂活性,并且其增强特异性免疫应答的效果与TLR激动剂CpG及MPLA存在协同作用。因此在设计纳米乳鼻内疫苗时,选择合适的TLR激动剂加以联合是理想的策略。5.本研究证实了T细胞表位肽纳米乳鼻内疫苗能有效诱导高水平的黏膜及系统免疫应答,对机体产生有效的免疫保护作用。