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甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)是由甲状旁腺主细胞合成分泌的、调节钙磷代谢及骨转换的重要肽类激素。人体血液循环中存在三种PTH分子:PTH1-84、PTH37-84及少量PTH7-84,后两者称为PTH羧基端肽段(C-PTH)。研究发现,PTH1-34具有与PTH1-84完全相同的受体结合能力及促成骨作用,美国FDA已于2001年批准甲状旁腺素(1～34)肽(rhPTH1-34)用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。但实验发现,当给予大鼠rhPTH1-34后骨肉瘤的发病率明显上升。近来发现,人体内存在C-PTH受体(CPTHR),C-PTH与其特异性受体结合后可产生促细胞凋亡的生物学效应。因此我们推测PTH1-34的成骨即抗成骨细胞凋亡作用可能诱发成瘤,而C-PTH的促凋亡作用可抑制PTH1-34的成瘤效应。该推测如果成立,将会对PTH在调节骨代谢方面作用的研究产生极其深远的影响。
目的：
拟采用基因工程手段,进行人pth1-84、pth7-84及pth37-84基因的克隆和重组多肽的表达,通过观察重组人PTH1-84、PTH7-84、PTH37-84(rhPTH1-84、rhPTH7-84、rhPTH37-84)及rhPTH1-34(市场购买)四种多肽片段对大鼠成骨细胞增殖的影响,初步揭示其在骨细胞周期及骨肿瘤发生中的调控作用。
方法：
1.PCR扩增目的基因以我室保存的人PTH原核表达载体PBV220/PTH1-84为模板,高保真DNA聚合酶(KOD Fx)催化,引物中引入限制性核酸内切酶SalⅠ和HindⅢ识别位点,PCR扩增PTH1-84、PTH7-84及PTH37-84编码区,琼脂糖凝胶电泳判断PCR产物分子量大小。
2.重组质粒的构建及序列分析将回收的PCR产物经限制性核酸内切酶SalⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆入经相同内切酶处理过的含有His-tag编码区的原核表达载体pQE-30Xa中,构建pQE-30Xa/PTH1-84、pQE-30Xa/PTH7-84及pQE-30Xa/PTH37-84三种原核重组表达质粒,转化入E.coli Trans-1感受态细胞,培养后提取质粒进行PCR及酶切鉴定,选取阳性重组质粒进行测序和表达。
3.重组表达质粒在原核细胞中的表达将己构建好的重组表达质粒转化入E.coli M15菌株,IPTG诱导表达。收集菌体超声碎菌,上清和沉淀分别收集低温保存。
4.表达产物的SDS-PAGE及Western Blot鉴定将菌体碎菌上清与沉淀分别进行浓度为15％的SDS-PAGE,观察多肽表达情况；表达产物电泳凝胶对硝酸纤维素滤膜恒压转膜,山羊抗人PTH羧基端多克隆抗体进行Western Blot鉴定,X-ray曝光观察显影情况。
5.表达多肽的分离纯化与浓度测定大量表达产物的碎菌上清进行Ni2+-IDA金属螯合亲和层析,收集洗脱液,BCA法测定纯化后总蛋白浓度,采用Chemi Genius凝胶成像分析系统分析目的多肽的纯度,计算多肽浓度。
6.PTH各种多肽片段对大鼠成骨细胞增殖的影响复苏冻存的大鼠成骨细胞,传代并接种于96孔板,待培养至细胞处于亚融合状态后分别加入不同浓度rhPTH1-84、rhPTH-1-34、rhPTH7-84及rhPTH37-84。作用24小时,MTT法检测570nm吸光度值,观察细胞增殖情况。
结果：
1.PCR扩增结果PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳,获得了约270 bp、250bp及160bp的清晰条带,与预期一致。
2.重组表达质粒的PCR及酶切鉴定重组表达质粒pQE-30Xa/PTH1-84、pQE-30Xa/PTH7-84及pQE-30Xa/PTH37-84经PCR初步鉴定,琼脂糖凝胶可见相应大小DNA片段；经Sal I和HindⅢ双酶切,得到约3500bp的pQE-30Xa线性片段和约270bp、250bp及160bp含目的基因的重组片段；酶切阳性质粒DNA测序分析与预期完全一致。
3.表达产物的SDS-PAGE及Western Blot鉴定诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,考马斯亮蓝R-250染色可见碎菌上清液中存在分子量与预期大小相符的蛋白条带；以抗人PTH羧基端多克隆抗体进行鉴定,显示有明显的蛋白质印迹带,证实条带为含有PTH羧基端肽段的多肽。
4.表达产物BCA浓度测定及纯度鉴定IPTG优化诱导表达后,产物经镍离子亲和层析法纯化,BCA法蛋白浓度测定及凝胶成像分析后计算rhPTH1-84、rhPTH7-84及rhPTH37-84三种融合多肽终浓度分别为:0.243mg/ml、0.203mg/ml、0.180mg/ml。
5.PTH各多肽片段对大鼠成骨细胞生长的影响MTT法检测各种多肽对大鼠成骨细胞增殖抑制率显示:rhPTH1-84、rhPTH1-34促进大鼠成骨细胞的增殖,而且rhPTH1-34的促增殖作用明显强于rhPTH1-84；rhPTH7-84及rhPTH37-84对大鼠成骨细胞显示增殖抑制作用,而且rhPTH37-84的增殖抑制作用明显强于rhPTH7-84。
结论：
1.采用PCR方法,扩增了编码人PTH1-84、PTH7-84及PTH37-84成熟多肽的基因,成功构建了融合表达质粒pQE-30Xa/PTH1-84、pQE-30Xa/PTH7-84及pQE-30Xa/PTH37-84,并经测序证实插入的DNA序列完全正确。
2.进行了IPTG诱导的原核系统蛋白表达,经凝胶成像系统分析,表达产物融合多肽6×His-PTH1-84、6×His-PTH7-84及6×His-PTH37-84在M15菌株中均得到高效表达。
3.Western Blot鉴定融合表达产物rhPTH1-84、rhPTH7-84及rhPTH37-84具有抗原性。
4.表达产物经镍离子亲和层析法纯化后,获得了高纯度的融合多肽,浓度理想。
5.MTT法检测证实了rhPTH1-84、rhPTH1-34具有促进大鼠成骨细胞增殖作用,而rhPTH7-84及rhPTH37-84两种C-PTH具有抑制细胞增殖的作用,为进一步研究甲状旁腺素及其羧基端肽段的功能奠定了基础。