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克伦特罗(clenbuterol，CBL)是一种禁用的动物促长剂，但违禁使用现象仍较普遍，危害严重。免疫分析法快速、简便、灵敏，特异性好，在食品安全快速筛查分析中优势突出。其中抗体是免疫分析的核心原材料。相比起制备周期长、制作成本高的多克隆抗体及单克隆抗体，周期短、成本低的基因工程单链抗体已经成为免疫分析研究中新的热点。在本实验室之前的工作中，已通过噬菌体抗体库技术获得了抗克伦特罗的单链抗体(CBL scFv)基因，并以包涵体的形式在大肠杆菌BL21实现表达。但仍存在表达量低，变性-复性过程导致的重组蛋白生物活性降低、操作繁琐等问题。相比之下，毕赤酵母（Pichia pastoris）作为工程菌可分泌表达外源蛋白，具有蛋白质翻译后修饰功能，且可通过发酵条件优化及密码子优化实现目标蛋白的高表达。为此，本论文在前期研究的基础上，构建重组抗CBL单链抗体毕赤酵母工程菌株，优化发酵条件及基因密码子，实现抗CBL单链抗体在毕赤酵母中的高效分泌表达，主要研究内容及结果如下：
(1)重组抗CBL单链抗体毕赤酵母工程菌株的构建、筛选及鉴定
将含有CBL scFv基因的pPICZαA穿梭质粒经BstXI内切酶线性化后，电转化毕赤酵母表达菌株GS115。PCR鉴定结果显示CBL scFv基因成功整合入GS115染色体基因组中。经Zeocin抗性梯度筛选及摇瓶发酵筛选，获得高表达转化子GS115/pPICZαA-CBL-6，将其诱导分泌表达的产物进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定。结果显示目标蛋白分子量为41kDa，表达量为0.095g/L，且可被鼠抗His标签单克隆抗体特异性的识别。
(2)重组毕赤酵母GS115/pPICZαA-CBL表达条件优化及CBL scFv活性分析
对表达时间、菌体密度、甲醇浓度、pH值等发酵条件进行优化，确定了在菌体密度A600nm为45，pH值为4.0，每24h加入1％甲醇(v/v)，诱导72h的表达条件下进行诱导，抗体产量的表达量最佳且具有较好的抗体活性。优化后CBL scFv表达量为0.125g/L，诱导上清经Ni-NTA亲和柱纯化后，蛋白纯度约为95%。将纯化后蛋白用于间接ELISA分析检测。结果显示CBL scFv纯化抗体能识别CBL-OVA抗原，对CBL药物有抑制作用，IC50值为5.82ng/mL，线性检测范围(IC20-IC80)为1.76-19.97ng/mL，最低检测限(IC10)为0.77ng/mL。
(3)CBL scFv基因进行密码子优化及其表达
根据毕赤酵母中密码子使用偏爱性，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，对CBL scFv序列进行密码子优化设计。人工合成了抗CBL单链抗体基因(CBL-synscFv)，将其克隆至表达载体pPICZαA上，构建毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-CBL-syn，将经BstXI内切酶线性化后的重组质粒电转化毕赤酵母表达菌株GS115，经Zeocin抗性梯度及摇瓶发酵筛选出高表达转化子GS115/pPICZαA-CBL-syn-3，诱导分泌表达，产物进行SDS-PAGE电泳鉴定和Western-blot鉴定。结果显示目标蛋白分子量为41kDa，且可被鼠抗His标签单克隆抗体特异性的识别，表达量为0.223g/L，是同等情况下原始基因毕赤酵母重组菌表达量的2.3倍。诱导上清经Ni-NTA亲和柱纯化后，蛋白纯度约为93%。将纯化后蛋白用于间接ELISA分析检测。结果显示CBL-syn scFv纯化抗体能识别CBL-OVA抗原，对CBL药物有抑制作用，(IC50)为5.55ng/mL，线性检测范围(IC20-IC80)为2.87-16.00ng/mL，最低检测限(IC10)为0.91ng/mL。