【摘 要】
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禽肉加工业的蓬勃发展导致全世界范围内每年产生约几百万吨羽毛废弃物,废弃物的处理成为亟待解决的问题。相较于物理和化学处理方法伴随的高能耗、高污染等弊端,生物法降解羽毛具有环境友好、能耗低和水解产物营养价值高等优点。角蛋白酶可以特异性地降解角蛋白,但是需要与还原剂协同作用才能实现对羽毛的高效降解,而二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇和亚硫酸盐等还原剂通常具有毒性或导致水解产物盐分过高。天然的羽毛降解菌
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禽肉加工业的蓬勃发展导致全世界范围内每年产生约几百万吨羽毛废弃物,废弃物的处理成为亟待解决的问题。相较于物理和化学处理方法伴随的高能耗、高污染等弊端,生物法降解羽毛具有环境友好、能耗低和水解产物营养价值高等优点。角蛋白酶可以特异性地降解角蛋白,但是需要与还原剂协同作用才能实现对羽毛的高效降解,而二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇和亚硫酸盐等还原剂通常具有毒性或导致水解产物盐分过高。天然的羽毛降解菌株因自身氧化还原代谢系统以及产角蛋白酶能力能够降解羽毛,但是降解效率低是其在工业应用中的主要障碍。为此,本研究以高活性角蛋白酶Ker Z1和Bacillus licheniformis BBE11-1为研究对象,优化了两者复配的体系来促进羽毛降解。另外,在Bacillus subtilis WB600中异源表达并优化了二硫键还原酶,通过Ker Z1和二硫键还原酶协同作用提升羽毛降解能力。主要研究结果包括:（1）联合降解羽毛体系的构建。基于Ker Z1和B.licheniformis BBE11-1单独降解羽毛分析,构建一种重组角蛋白酶和野生产酶菌株联合降解羽毛的体系。通过单因素和正交试验对B.licheniformis BBE11-1培养体系以及与角蛋白酶Ker Z1的复配条件进行优化。结果在40℃、p H 10.0、角蛋白酶活50 k U·m L-1、B.licheniformis BBE11-1接种量10%条件下水解36 h,对100 g·L-1鸭毛降解率达74%,较Ker Z1和B.licheniformis BBE11-1单独降解分别提高了18%和15%;在40℃、p H 10.0、角蛋白酶活30 k U·m L-1、B.licheniformis BBE11-1接种量8%条件下水解32 h,对100 g·L-1鸡毛降解率为64%,比Ker Z1和B.licheniformis BBE11-1单独降解分别提高了29%和28.5%。（2）二硫键还原酶的重组表达。将来源于B.subtilis 168的4种二硫键还原酶:烷基过氧化物还原酶（Ahp C）、二氢硫辛酸脱氢酶（DLD）、肽甲硫氨酸亚砜还原酶（Msr A）和硫氧还蛋白还原酶（Trx R）在B.subtilis WB600中成功胞外表达,比酶活分别是0.53 U·mg-1、1.69 U·mg-1、16.7 U·mg-1和2.06 U·mg-1;4种二硫键还原酶与Ker Z1复配均能促进角蛋白酶降解羽毛,其中,Msr A+Ker Z1复配降解羽毛时水解液中可溶性蛋白含量是Ker Z1单独水解时的3倍。（3）信号肽筛选提升二硫键还原酶活性。选取枯草芽孢杆菌内源12种信号肽进行筛选,其中Pel C、Npr E、Pho D、SPker、Ywb N、Yxk H信号肽,分别使Msr A胞外二硫键还原酶酶活提高1.4、1.8、2.0、2.2、2.6和4.2倍,Yxk H信号肽使其胞外分泌量显著提高。（4）二硫键还原酶重组表达菌株的发酵优化。对携带Yxk H信号肽的Msr A菌株(WB600-p P43NMK-mrs ASPyxk H)进行发酵优化。试验确定优化后的发酵培养基为1.5%可溶性淀粉、4%玉米浆、2%NH4Cl、0.2%Na2HPO4·12H2O、0.1%KH2PO4、0.08%Ca2+,培养条件为初始p H 9.0、温度37℃、接种量5%,优化后二硫键还原酶酶活4.9 U·m L-1,提高了5倍,与Ker Z1复配羽毛降解率提高了11%。（5）羽毛水解产物的成分及应用潜力分析。使用高效液相色谱对水解液中可溶性蛋白、多肽分子量分布进行测定,鸭毛和鸡毛水解液中可溶性蛋白、多肽含量分别是5.6 g·L-1和3.2 g·L-1。采用氨基酸分析仪对羽毛水解液中氨基酸含量进行分析,100 g·L-1鸭毛和鸡毛水解液中总氨基酸含量分别为7472.33 mg·L-1和5589.67 mg·L-1。在LB成分基础上添加10%(v·v-1)羽毛水解液,WB600-p P43NMK-ker细胞密度较对照提高了2～2.4倍,角蛋白酶酶活提高了1.5倍;将10%羽毛水解液完全代替LB培养基中的碳氮源后,细胞密度和酶活较对照无显著差异。使用10%(v·v-1)羽毛水解液浇灌玉米种苗,三周后植株鲜重较对照提高了1.4～1.7倍。
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