富马酸是三羧酸循环(TCA)的中间产物,在许多领域具有广泛的应用。目前,富马酸主要以石油基产品为原料化学合成。然而,由于石油资源的不可再生性及化学合成法对环境的污染问题,急需开发一种富马酸生产的替代方法。生物发酵法具有成本低、易操作、环境友好等特点,日益受到人们的关注。近年来,随着基因工程、代谢工程技术的发展,研究者逐渐开始对各类天然产物的发酵及代谢过程进行人工设计和改造,以达到进一步提高发酵产率的目的。富马酸生产的天然菌株为根霉菌,由于其遗传及代谢背景尚不明晰,目前大多数关于富马酸代谢研究的工作多以模式生物大肠杆菌为平台,进行代谢及改造的研究。在实验室前期的工作中,以大肠杆菌JM109为平台,通过敲除富马酸还原酶基因(frdABCD)、富马酸酶基因(fumA、fumB与fumC)、局部转录因子(iclR)以及全局转录因子(arcA),构建了富马酸基因工程菌株Strain ABCDIA。该菌株发酵生产富马酸的产量有了明显的提高。然而,由于工作过程中敲除基因过多,导致菌体生物量下降明显,同时在工作过程中发现某些基因的敲除对富马酸产量的提高没有正面影响。基于上述问题本文的研究工作主要围绕以下几个方面展开:(1)以菌株Strain ABCDIA为基础,构建了半乳糖透性酶(GalP)转运体系,与PTS葡萄糖转运体系相比,菌株StrainABCDIA的富马酸产量提高了约50%。在此基础上,构建了苹果酸脱氢酶基因(mdh)敲除菌株,富马酸产量提高了约16.85%;进一步表达乙酰辅酶A合成酶基因(acs)后,富马酸产量显著提高,较菌株Strain ABCDI4提高了 115.49%。最后,以乙酸为碳源对上述重组菌进行发酵研究,为利用粗乙酸发酵生产富马酸提供了可行性依据。(2)基于前期工作中敲除基因过多,造成生物量严重下降的问题,经分析实验结果发现只有基因fumB、arcA的敲除对富马酸产量有积极影响。因而,对前期工作进行了优化整合,以菌株Escherichia.coli JM109为出发菌株,敲除其fumB、arcA基因。并结合半乳糖透性酶转运体系、共表达苹果酸脱氢酶基因(mdh)与柠檬酸合成酶基因(gltA)、构建乙酸回补途径。最终,将富马酸的产量由原始菌株E.coli JM109的5 mg/L提高至 77.9 mg/L。(3)研究能量代谢对产富马酸的影响,对胞内辅因子水平进行调节。通过过表达大肠杆菌自身转氢酶基因(sthA)与肺炎链球菌的NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)氧化酶基因(noxE),提高了胞内NAD+/NADH的比值。经发酵实验验证,富马酸的产量分别提高了 93.5%与 19.5%。