研究背景：MicroRNA(miRNA)是一种长度约18-25nt的非编码小RNA,起转录后调控作用。MicroRNA一般由位于基因内含子中的miRNA基因转录生成原始miRNA,在细胞核内被RNA酶ⅢDrosha-DGCR复合体切割形成由70个核苷酸组成的前体miRNA,而后由转运蛋白Exportin-5转运到细胞质,在细胞质中前体miRNA被Dicer酶切割形成长度约22nt双链RNA,随后与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合,形成RISC-miRNA复合体,此后一条链降解,另一条链保留在复合体内生成为成熟的microRNA。RISC-miRNA复合体与靶基因mRNA配对,起转录后调控作用：当miRNA与靶基因mRNA以完全或近似完全互补的方式结合在阅读框时,靶基因mRNA发生特异性降解；当miRNA与靶基因与部分互补的方式结合在靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR),则抑制其翻译,不影响其稳定性。上述过程显示miRNA可以在转录后水平调控各个基因的表达,进而调控细胞的分化、增殖及凋亡,参与生物体发育、代谢。研究发现人体内大约有1000种miRNA,调控着人体约1/3的基因表达。一种miRNA可作用于多种mRNA,多种miRNA可共同作用于一种mRNA。mRNA的3’UTR可以包含多个miRNA的作用位点,并且与抑制翻译的程度有关,miRNA作用的位点越多,抑制的程度就越大。从而形成一个复杂而精确的网络,调控机体的基因表达及生理功能,当miRNA表达水平失去平衡,就可能导致疾病的发生。miRNA存在于多种组织液中,且性质稳定,有研究发现血清中含有miRNA、rRNA、mRNA等多种不同类型的小分子RNA,但主要以miRNA为主。亦有学者研究发现包括尿液、唾液、脑脊液、精液、胸腹水等多种人体体液中存在一定数量的miRNA分子。血清中miRNA能够抵抗RNA酶的降解,在血清中非常稳定。血清MiRNA可长期放置,如室温放置一周后miRNA仅有微量的变化,在煮沸、强酸、强碱的极端条件下miRNA含量均未见明显变化,此外保存多年的石蜡切片组织仍可检测到miRNA分子。正常的细胞基因稳定有序表达,确保细胞的分裂、分化和凋亡过程协调有序进行,而基因的异常表达导致细胞无限增殖、正常凋亡失控,从而导致肿瘤的发生。目前相关研究发现microRNA与肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等多数肿瘤相关,在这些肿瘤细胞中可发现microRNA的表达异常,但它们的具体机制并未完全研究明了。miRNA与肿瘤的关系的研究主要基于以下发现：1.miRNA基因主要位于肿瘤相关基因组区及基因组不稳定区域；2.miRNA在正常组织细胞与肿瘤细胞中表达不相同,肿瘤细胞中存在某些miRNA特异性表达增多或减少,提示MiRNA可能为肿瘤的发生创造条件；3.有研究发现某些miRNA可直接调控肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡。大量研究表明,miRNA与肿瘤发生、进展、转移和预后存在着密切的联系。鉴于miRNA这些特点,使其在研究肿瘤发病机制、分子诊断以及判断预后等方面发挥着重要的作用。肾上腺皮质癌是一种临床少见的恶性肿瘤,占全身恶性肿瘤的0.2%,恶性程度高,侵袭能力强,初次诊断时常发现远处转移,且复发率高。5年生存率低于30%。术前临床诊断困难,术后肿瘤与良性肾上腺肿瘤镜下难于鉴别。寻找更好的生物学标志对肾上腺皮质癌的诊断、治疗、预后等显的尤为重要。近年来对肾上腺皮质癌基因标志、血清学标志及细胞学等生物学标志进行了大量的研究,但由于这些指标特异性低及敏感性差,临床应用仍存在较多缺陷。肾上腺皮质癌发生与发展同其他恶性肿瘤一样,是一个包括原癌基因激活和(或)抑癌基因失活的多阶段多步骤的过程,而基因突变、染色体异常等基因遗传学变化在此过程扮演着及其重要的角色,与此同时miRNA异常表达造成的原癌基因激活和(或)抑癌基因失活等表观遗传学的改变也发挥着重要的作用。目前研究发现多种miRNA在肾上腺皮质癌中异常表达,且在肾上腺皮质癌的发生、发展及预后中充当着重要的角色。Ozata等人采用采用微阵列分析及qRT-PCR技术研究发现miR-483-3p、miR-483-5p、miR-210及]miR-21在肾上腺皮质癌组织中较肾上腺腺瘤及正常组织中呈高表达,而miR-195、miR-497、 miR-1974在肾上腺皮质癌组织中较腺瘤或正常组织低表达。进一步细胞实验研究发现,在NCL-H295R人肾上腺皮质癌细胞中,抑制miR-483-3p及miR-483-5p的表达或增加miR-195及miR-497表达可抑制肿瘤细胞的增殖,抑制miR-483-3p同时增加miR-195及miR-497表达则可导致肿瘤细胞的死亡。我们前期通过实时荧光定量PCR技术及免疫荧光技术对比研究发现,肾上腺皮质癌miR-205表达较正常肾上腺组织miR-205低,随后研究发现上调miR-205的表达可以抑制人肾上腺皮质癌细胞株SW-13的增殖。miR-205首次是在在保护小鼠及红鳍东水纯基因序列的基础上,通过计算机方法被预测出来,随后在人类体内得到确认。miR-205基因定位于1号染色体LOC642587位点第二内含子上。在人类乳腺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞中明显低表达。由于miRNA存在多种不同的靶基因,因此在不同的肿瘤中miR-205起调控作用的靶基因也不完全相同,Paolo Gandellini研究发现在前列腺癌中,miR-205较正常组织表达下调,并能抑制前列腺癌细胞的增殖及转移,同时发现PKCε是miR-205的靶基因,miR-205通过靶向调节PKCε的表达而发挥抑制肿瘤的作用。Shahana Majid研究发现在肾癌细胞中,miR-205呈低表达,miR-205可以靶向抑制Src、Lyn、Yes的表达,抑制Src信号通路,从而发挥抑制肿瘤的作用。本课题基于此研究背景,在人肾上腺皮质癌细胞株SW-13中上调miR-205表达,通过预测软件寻找miR-205新的靶基因,并进行验证,以初步探讨其在肾上腺皮质癌中的作用机制。目的：1.通过查找miRNA相关网站,寻找miR-205可能的靶基因；2.在人肾上腺皮质癌细胞株SW-13中上调miR-205的表达,通过实时荧光定量PCR分析验证其发挥作用的靶基因；3.检测细胞周期及凋亡相关蛋白的变化,初步探索miR-205在肾上腺皮质癌发生、发展中可能的分子机制。方法：1.通过miRNA预测相关网站PicTar(www.pictar.mdc-berlin)及Target Scan (www.targetscan.org)及miRSVR(www.microrna.org/microrna/home.)寻找miR-205潜在的靶基因。2.通过构建miR-205真核表达载体,进一步转染进入人肾上腺皮质癌细胞株SW-13细胞中,形成miR-205上调表达的SW-13细胞(miR-205组),同时设置对照组及空白组：转染了阴性对照的miRNA的SW-13细胞为对照组,未转染任何试剂的SW-13细胞为空白组。3.提取细胞总RNA,进行逆转录后行荧光实时定量PCR,分析并验证miR-205上调表达对其相关靶定基因表达的影响,同时提取细胞总蛋白行western blot验证其蛋白表达情况。4.通过western blot技术分析miR-205过表达对靶基因下游蛋白(Bax、 Caspase-3、p27、cyclingD1、E-cadherin、caspase-9)蛋白表达水平的影响。5.对western blot胶片进行扫描,使用Quantity one测量各组间灰度值；用Opticon Montor软件分析实时荧光定量PCR结果,得出各标本达到荧光阈值所需Ct值,采用2-ΔCt计算各组基因的相对表达量(计算方法：ΔCt=各组基因Ct值一内参基因Ct值,基因的相对表达量=2-ΔCt)。应用SPSS13.0统计软件进行统计学学分析,采用ONE-WAY ANOVA检验各组间有无差异,以P<0.05为有统计学意义。结果：1.通过miRNA预测相关网站PicTar (pictar.mdc-berlin)及Target Scan(www.targetscan.org)及miRSVR(www.microma.org/microma/home.)寻找miR-205潜在的靶基因。查找出miR-205潜在的靶基因：PCAF、E2F1、VEGF-A、Bcl-2;2.构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-205,测序结果与miRbase中的序列一致,转染进入SW-13细胞后采用实时荧光定量PCR检测结果显示miR-205组细胞内miR-205的表达水平较对照组及空白组升高约63.2倍((P<0.01),而对照组及空白组细胞miR-205表达水平无明显差异(P>0.05),表明重组表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205能够在SW-13细胞中高水平表达miR-205.3.western blot研究结果显示,miR-205组中PCAF、E2F1、VEGF-A、Bcl-2等蛋白表达水平均低于空白组和对照组(P均<0.05),而对照组及空白组之间表达水平无差异(P>0.05)；4.实时荧光定量PCR检测结果显示,在人肾上腺皮质癌细胞株SW-13细胞上调miR-205的表达后,PCAF、E2F1、VEGF-A、Bcl-2表达均发生下降。与空白组及和对照组相比较,差异均有统计学意义(P均<0.05),而空白组与对照组相比较,各基因mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。5.western blot研究结果显示,miR-205组中Bax、Caspase-3、Caspase-9、 E-cadherin等蛋白表达水平均高于空白组和对照组(P值均<0.05),而空白组及对照组间表达水平无差异(P均>0.05)；同时miR-205组中cyclingD1表达下降(P<0.05),P27蛋白三组间表达水平无差别(P>0.05)结论：1.在人肾上腺皮质癌细胞株SW-13中,miR-205上调可以抑制Bcl-2的表达,导致线粒体凋亡通路下游蛋白Bax、caspase-3、caspase-9的表达增加,促进细胞凋亡,从而发挥抑制肿瘤生长作用。2.上调miR-205的表达抑制E2F1的表达,抑制cyclinD1的表达,导致细胞周期调控失常,细胞从G1向S转换受阻,细胞增殖受限,肿瘤发生、发展受抑制。3.上调miR-205表达后,介导肿瘤组织血管生成的VEGF-A从mRNA及蛋白水平均发生不同程度的减少,同时导致介导细胞间粘附因子E-cadherin表达增加,细胞间粘附相应增强,miR-205可以抑制VEGF的表达上调E-cadherin的表达抑制肿瘤的侵袭转移。4. miR-205在肾上腺皮质癌细胞株中可以从mRNA及蛋白水平抑制PCAF的表达,导致细胞增殖受限,肿瘤发生、发展受阻。