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蜕皮是凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)整个生命周期中一个重要的生理过程,这一过程受外部环境因素影响,同时也受体内神经系统和内分泌系统的协同调控。蜕皮是以蜕皮激素合成为核心的蜕皮激素信号通路上下各基因级联调控的过程,如在昆虫纲动物中蜕皮激素信号通路上游高血糖激素(CHH)家族神经肽抑制蜕皮激素的合成,而蜕皮激素信号通路下游基因羽化激素(EH)和蜕皮触发激素(ETH)受蜕皮激素调控可以触发蜕皮行为的发生。与节肢动物门昆虫纲动物相比,甲壳动物蜕皮信号通路各个基因的研究很不全面,大多数借鉴于昆虫等动物,特别是蜕皮激素信号通路相关功能基因在蜕皮过程的调控机制有待更深入的探究。本论文以凡纳滨对虾CHH、EH和ETH为研究对象,运用原核表达系统制备体外重组蛋白和结合RNAi等技术,分析比较转录组数据,通过体内注射和体外组织孵育实验,研究CHH影响蜕皮激素合成,而EH和ETH在蜕皮激素的调控下参与对虾蜕皮,同时确认了ETH通过其受体协同参与对虾蜕皮调控。研究围绕蜕皮激素,旨在阐明蜕皮激素信号通路上下游相关功能基因参与调控凡纳滨对虾蜕皮的分子机制。研究的初步结果如下:1、LvCHH-L通过抑制蜕皮激素合成调控凡纳滨对虾蜕皮分子克隆和生信分析显示LvCHH-L具有典型的CHH I型家族神经肽的结构特征,在成熟肽和信号肽之间存在CPRP结构,成熟肽存在6个保守的半胱氨酸残基。眼柄组织是蜕皮间期对虾LvCHH-L表达的主要部位(P<0.05),在蜕皮间期LvCHH-L转录水平显著最高(P<0.05),并随蜕皮临近而逐步降低转录水平。抑制LvCHH-L转录水平显著加速了对虾蜕皮和提高蜕皮率(P<0.05);连续抑制LvCHH-L转录水平显著增加了对虾体重(P<0.05),加快了对虾生长;注射ds LvCHH-L显著升高了蜕皮激素合成途径催化酶NVD和SAD的转录水平以及蜕皮激素受体Ec R的转录水平(P<0.05);干扰LvCHH-L的转录提高了对虾血淋巴蜕皮激素浓度,促使对虾提前蜕皮。结果表明LvCHH-L抑制蜕皮激素的合成,从而参与调控凡纳滨对虾蜕皮。2、饲料中添加蜕皮激素的凡纳滨对虾比较转录组分析投喂不同蜕皮激素含量的饲料(0、200、400和800 mg/kg)养殖凡纳滨对虾两个月后,对凡纳滨对虾肝胰脏和肠组织进行了比较转录组分析,分别获得了大小为39361266~45214394等24个高质量读数数据库,经过比对到凡纳滨对虾基因组和未比对到的读数进行新基因的预测,共得到32623个转录本,其中最短的为57 bp,最长的为40511 bp,GO数据库富集到的转录本65140次,KEGG数据库富集到的转录本12394次。差异基因分析结果表明蜕皮信号通路的关键基因EH、ETH、几丁质合酶(CHS)、HR38、几丁质酶(CHITINASE)和维甲类X受体(RXR)在肝胰脏800mg/kg实验组中显著上调(P<0.05);肠组织800 mg/kg实验组中细胞色素P450酶系在KEGG差异通路有显著富集;INSIG-SREBP-SCAP信号通路中SREBP基因随蜕皮激素含量增加表达量下调。蜕皮信号通路中,从蜕皮激素合成的原材料胆固醇的调控蛋白结合原件SREBP,广泛参与蜕皮激素合成途径的细胞色素P450酶系,以及蜕皮信号通路下游基因都在不同蜕皮激素含量饲料投喂组表达有显著差异。通过本研究的转录组数据分析,挖掘了受蜕皮激素调控的对凡纳滨对虾蜕皮生长关键的信号通路和基因。3、LvEH参与凡纳滨对虾蜕皮调控由转录组数据筛选到LvEH基因是凡纳滨对虾蜕皮激素信号通路关键功能基因,生信分析显示LvEH基因ORF长249 bp,编码26个氨基酸形成的信号肽和56个氨基酸形成的成熟肽,成熟肽内含可以形成分子内稳定二硫键的6个半胱氨酸残基。在蜕皮间期凡纳滨对虾鳃、表皮以及脑是LvEH基因主要表达部位,在对虾幼体由无节幼体变态为蚤状幼体过程中,LvEH基因转录水平高,LvEH基因在蜕皮间期转录水平最低(P<0.05),并随蜕皮来临逐步升高。运用原核表达技术成功制备了分子量为26.8k Da的重组蛋白r LvEH,结合RNAi技术研究LvEH对对虾蜕皮的调控。蜕皮激素体外孵育实验表明一定范围内增加蜕皮激素浓度显著促进了LvEH的表达(P<0.05);干扰LvEH的转录,显著延缓了对虾蜕皮(P<0.05),但是通过共注射ds LvEH和r LvEH对对虾的蜕皮率无显著影响(P>0.05);注射r LvEH加快了对虾生长,而注射ds LvEH明显延缓了对虾生长;LvEH对下游基因LvETH、LvETHR、Lv Burs和LvCCAP表达有显著的促进作用(P<0.05)。结果表明,LvEH受蜕皮激素调控,并影响下游基因的表达而参与凡纳滨对虾蜕皮调控。4、LvETH协同LvETHR参与凡纳滨对虾蜕皮调控由转录组数据筛选到蜕皮激素信号通路功能基因LvETH,克隆获得LvETH基因ORF长405 bp,编码134个氨基酸,前19个氨基酸形成信号肽。对虾蜕皮间期LvETH基因在肌肉和眼柄组织表达量高,无节幼体N6和N5期LvETH转录水平高,对虾蜕皮间期LvETH转录水平最低(P<0.05),并在蜕皮前逐步升高。通过分子对接和酵母杂交实验验证了LvETH受体,结果表明LvETH和LvETHR分子间可以形成稳定的化学键,酵母杂交表明两者具有强的相互作用,干扰LvETH的转录同时也显著降低了LvETHR的转录水平(P<0.05)。体外孵育实验表明LvETH的受蜕皮激素的调控;联合注射实验表明,注射ds LvETH或者ds LvETHR延缓了对虾蜕皮,但用人工合成多肽sys ETH进行补救可以恢复对虾蜕皮;注射ds LvETH延缓了对虾生长,而注射sys ETH加速了对虾生长。结果表明,LvETH协同LvETHR参与凡纳滨对虾蜕皮调控。