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目的:基于方证相对原理,通过肝肾纤维化方证数据库筛选分析,选择膈下逐瘀汤、复肝丸、燮枢汤、鳖甲饮子活血化瘀类方4首,观察类方分别对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)模型大鼠肝纤维化、四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)模型小鼠肝纤维化的药效作用,并基于脂质过氧化损伤探讨有效复方抗肝纤维化的作用机理。 方法:本论文分为2个部分。 第一部分:活血化瘀类方抗肝纤维化的疗效比较 1.1、活血化瘀类方对DMN模型大鼠肝纤维化的疗效比较。 0.5%DMN腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型,分为正常组、模型组、膈下逐瘀汤组、复肝丸组、燮枢汤组、鳖甲饮予组和N-乙酰半胱氨酸对照药组。造模大鼠予DMN10μg/kg体重腹腔注射,每周连续3天,每天1次,共4周。造模第3周起,正常组与模型组分别予饮用水灌胃,各治疗组分别予膈下逐瘀汤、复肝丸、燮枢汤、鳖甲饮子复方浸膏灌胃,每天1次,连续4周。所有大鼠于第6周末处死。试剂盒测定血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)活性及白蛋白(Albumin,Alb)、总胆红素(total bilirubin,TBil)含量;盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量;HE染色与天狼猩红染色观察肝组织炎症与胶原沉积情况。 1.2、活血化瘀类方对CCl4模型小鼠肝纤维化的疗效比较。 10%CCl4腹腔注射诱导小鼠肝纤维化模型,分为正常组、模组型、膈下逐瘀汤组、复肝丸组、燮枢汤组、鳖甲饮子组。造模小鼠均予10%CCl4腹腔注射,剂量为2ml/kg体重,2日1次,每周3次,共4周。造模第一日起,正常组与模型组均予饮用水灌胃,各治疗组分别予膈下逐瘀汤、复肝丸、燮枢汤、鳖甲饮子浸膏灌胃,每日1次,连续4周。所有小鼠于第四周末处死。试剂盒测定血清ALT、AST、γ-GT活性及Alb、TBil含量;盐酸水解法测定肝组织Hyp含量;HE染色与天狼猩红染色观察肝组织炎症与胶原沉积情况。 第二部分:活血化瘀类方抗肝纤维化氧化损伤机理研究。 基于以上两批模型动物的药效结果,筛选出的抗肝纤维化效果较好的复方,经试剂盒法检测肝组织过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondiahdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)水平,进一步探讨其抗肝纤维化作用的可能机制。 结果: 1、DMN模型:与正常组比较,模型组大鼠体重明显降低,脾/体比升高,腹水形成;血清ALT、AST、Tbil均显著升高,肝组织Hyp含量明显升高,血清Alb明显降低;肝组织病理染色可见大量炎性细胞浸润、胶原纤维沉积明显,纤维间隔形成,严重者可见较多假小叶形成。与模型组比较,复肝丸组、N-乙酰半胱氨酸组脾体比、ALT、Hyp含量等显著降低,肝细胞变性和炎症坏死明显减轻,胶原沉积明显减少,AST、Tbil、γ-GT无明显变化;膈下逐瘀汤组脾体比、ALT、Hyp含量等降低,但死亡率较高,肝组织病理炎症及纤维化程度均较重;燮枢汤组脾体比降低,其余指标无明显变化;鳖甲饮子组脾体比降低,ALT、Hyp含量有所降低,但肝细胞变性、炎症坏死和胶原沉积无明显变化; CCl4模型:与正常组相比,模型组小鼠体重明显降低,肝体比、脾体比明显升高;血清ALT、AST、TBil、γ-GT均显著升高,肝组织Hyp含量明显升高。肝细胞变性及炎性坏死明显。胶原纤维沉积明显,形成纤维间隔,并可见假小叶形成。与模型组比较,复肝丸组脾体比降低、AST、γ-GT显著降低,肝细胞变性和炎症坏死有所减轻,胶原沉积显著减少,Hyp含量明显降低;膈下逐瘀汤组脾体比和γ-GT显著降低,肝细胞变性和炎症坏死有所减轻,胶原沉积有所减少;燮枢汤组脾体比降低,但炎症和纤维化程度未减轻;鳖甲饮子组AST有所降低,但肝细胞变性、炎症坏死和胶原沉积没有明显减少。 2、与正常组相比,DMN模型组大鼠肝脏组织中SOD、GSH、GSH-Px水平均明显降低,而MDA、ACP水平升高;与模型组相比,复肝丸组SOD、GSH、GSH-Px水平均明显升高,接近正常组水平,而MDA、ACP水平降低。CCl4模型组小鼠肝脏组织中SOD、GSH、GSH-Px水平均明显降低,而MDA、ACP水平升高;与模型组相比,复肝丸组SOD、GSH、GSH-Px水平均明显升高,接近正常组水平,MDA水平降低,而ACP水平未见明显变化。 结论: 1、复肝丸有较好的抗DMN大鼠肝纤维化作用,其作用效果与N-乙酰半胱氨酸相似;复肝丸有较好的抗CCl4小鼠肝纤维化作用。 2、复肝丸抗肝纤维化作用机制与其抗脂质过氧化损伤有关。