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D-塔格糖是一种在自然界存在极少的功能性已酮糖,可以应用于食品、医药、保健及化妆品等多种领域。本文研究利用微生物酶生物转化D-半乳糖为D-塔格糖,为实现从廉价糖原料到稀少糖的转化奠定基础。1.菌种筛选：实验从土壤中分离出一种可产生L-阿拉伯糖异构酶转化D-半乳糖生产D-塔格糖的嗜热菌株No.6。经菌体及菌落形态、生理生化特性以及16S rDNA进化树分析等方法,将其鉴定为Anoxybacillus flavithermus。实验表明该菌株有一个广泛的生长温度(45-70℃)和pH(5.5-9.5),最适温度55℃和最适pH为8.5。2.克隆表达：将No.6菌株编码L-阿拉伯糖异构酶的基因片段克隆到E. coli BL21(DE3)中进行诱导表达。经SDS-PAGE分析检测重组L-阿拉伯糖异构酶蛋白分子量约为56.3kDa,所表达目的蛋白占菌体总蛋白的22.5%。3.蛋白纯化：将诱导好的菌株用超声波细胞破碎仪破碎、4℃离心12000rpm离心10min后收集上清液,80℃热处理10min以去除宿主蛋白,12000rpm离心10min收集上清。由于表达出的蛋白质带有6×His表达标签,可进一步利用Ni-NTA进行亲和柱层析来提纯表达出的蛋白质。初步纯化结果显示纯酶得率可以达到30mg/L,纯度可达到90%以上,并检测其酶活为26.4U/mg。4.酶学性质研究：结果表明重组的L-阿拉伯糖异构酶是一个极端嗜热嗜碱的异构酶,最适温度和pH分别为95℃和9.5-10.5;其活性并不依赖金属离子；该酶还对D-半乳糖具有较高的底物特异；转化D-半乳糖的Vmax为454.55μmol/L·min,Km为26.81mM；硼砂可以提高重组酶的催化效率,使kcat/Km提高一倍。5.酶法合成D-塔格糖的研究：该酶在最适温度95℃、pH9.5的硼砂缓冲液中反应1h,D-半乳糖转化生成D-塔格糖的转化率可以达到60%以上。