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狂犬病病毒(Rabies virus, RV)是弹状病毒科狂犬病病毒属的成员,是一类高度嗜神经性病毒,能导致所有温血动物高致死性疾病。目前狂犬病的致病机理尚未清楚,无治疗方法,只能通过加强疫苗预防予以控制,因此深入研究其致病机制,寻找新的途径来预防和治疗尤为重要。miRNA是一类内源性、长约为21-23nt的非编码蛋白的单链小分子RNA,通过与靶基因完全和不完全配对起到降解mRNA或抑制mRNA翻译的功能,是一类重要的基因调节子。它在机体的基因表达调控、细胞分化、细胞凋亡及抗病毒防御中发挥着重要作用。本实验用正常和感染了狂犬病病毒GX01的小鼠脊髓组织抽提总RNA,构建Small RNA文库并上机测序分析后,获得病毒感染前后小鼠脊髓miRNA的表达谱,其中表达上调3倍以上的有4个：miR-34a-3p、 miR-155-5p、miR-223-3p和miR-223-5p;表达下调3倍以上的只有1个miR-193b-5p。对这5个差异表达的miRNA进行靶基因预测后再进行KEGG pathway分析,同时也用计算机预测并验证获得了139个新的miRNA与狂犬病病毒感染有关。在此基础上,本实验还对miR-34a-3p、miR-155-5p和miR-223-3p这3个表达差异的miRNA进行了real-time qRCR验证,结果表明,两种方法检测呈表达趋势相似的为miR-155-5p和miR-223-3p,均呈上调趋势,但miR-34a-3p差异倍数并不相符,初步推测该结果可能与检测方法有关。本研究选取了miR-101c、miR-155和miR-223这3个差异表达的miRNA,从miRBasce中获取目的基因后,扩增包含其前体在内的miRNA初级转录物片段,构建了3个重组质粒pEGFP-C1-miR-101c pEGFP-C1-miR-155和pEGFP-C1-miR-223,并成功在BHK细胞上表达。同时探索了3个重组质粒与狂犬病病毒的相互作用,希望找出miRNA通过与病毒的哪些基因作用而发挥抗病毒功能。结果表明,3个重组质粒均能在一定程度上降低病毒滴度,抑制了病毒增殖速度。而狂犬病病毒N基因的表达在病毒感染12h和24h后无显著影响,在感染48h和72h出现不同程度的上调；狂犬病病毒N蛋白的表达则均未出现显著影响。miRNA的表达对狂犬病病毒增殖的影响及其与宿主的相互作用关系还有待进一步研究。