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目的鉴定肺炎链球菌中spxB基因编码蛋白的丙酮酸氧化酶活性、保守性表达和细胞表达定位,并初步探索该蛋白对细菌毒力的影响及与肺炎链球菌伴侣蛋白DnaJ相互作用的部分机制。方法利用PCR方法扩增肺炎链球菌D39菌株的spxB基因全长序列，并将其整合至表达载体pET-28a(+)，经测序鉴定后，将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)，以IPTG诱导表达含有His标签的rSpxB蛋白，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，使用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，采用ASAHI KASEI公司购买的丙酮酸氧化酶T-45酶为标准品，根据其说明书的方法进行SpxB酶活性检测。以rSpxB蛋白免疫昆明小鼠获得其多克隆抗体。采用ELISA检测多克隆抗体效价，采用Western Blot鉴定抗体的特异性和蛋白的保守性表达。采用流式细胞术鉴定SpxB的细胞表达定位。构建spxB缺陷菌，通过与流感嗜血杆菌进行共同培养初步探索其对肺炎链球菌毒力影响的机制。使用直接结合实验和生物膜干涉技术确证肺炎链球菌伴侣蛋白DnaJ与丙酮酸氧化酶SpxB的直接相互作用，通过热变性SpxB蛋白再折叠实验探索DnaJ对SpxB的作用效应。检测热休克后过表达DnaJ的S.pn菌株与未过表达DnaJ菌株H2O2产量，探索热休克时DnaJ蛋白过表达是否影响SpxB活性。结果成功表达纯化了纯度达90%的重组SpxB蛋白，经实验鉴定具有丙酮酸氧化酶活性，重组SpxB蛋白免疫小鼠后能有效刺激小鼠血清中产生滴度达1:2560000的抗体。流式细胞术检测显示SpxB蛋白的荧光信号较阴性对照有右移，但较阳性对照的荧光信号弱。Western Blot结果证实了SpxB在7种不同血清型肺炎链球菌中均有保守表达。缺陷SpxB后，肺炎链球菌产生H2O2的量显著降低，对流感嗜血杆菌的生长抑制作用消失。直接结合实验结果显示，随着SpxB蛋白浓度的增高，DnaJ结合的SpxB量呈剂量依赖性增加；生物膜干涉技术结果显示，DnaJ与丙酮酸氧化酶SpxB的亲和常数KD值为2.03×10-7。热变性失活的SpxB在DnaK/DnaJ存在条件下可恢复9%左右的活性。热休克后过表达DnaJ蛋白菌株与未过表达DnaJ蛋白菌株的H2O2产量无显著差异。结论肺炎链球菌丙酮酸氧化酶SpxB在不同血清型S.pn中保守性较高，主要表达于胞内，可能通过产生H2O2抑制其他细菌从而使S.pn占据一定生长优势。SpxB与肺炎链球菌DnaJ有直接相互作用，DnaJ/DnaK能帮助热失活的SpxB蛋白再折叠恢复天然构象。