在机体内,正常生理浓度的活性氧(ROS)是维持正常细胞生理功能所必需的,而过量的ROS则会对各种生物分子,诸如:蛋白质,脂类(包括脂蛋白)、DNA等,造成损伤。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)组成了体内微型的抗氧化系统,在维持机体ROS正常水平方面起着非常重要的作用,能有效保护细胞免遭氧化损伤,也因此具有广阔的药用前景。但天然酶的生物医学应用常被很多因素所限制。如SOD在一定情况下会产生细胞毒性,只有与其它过氧化物清除酶,如GPX的水平达到一定的平衡时才能真正起到抗氧化作用。而GPX的催化基团是被称为第21种氨基酸的硒代半胱氨酸(Sec),很难利用传统的基因工程方法表达。因此,对抗氧化酶的模拟不仅对阐明酶的催化机理以及相互间的协同作用有重要意义,而且还具有重大的药用价值。自然界中多数蛋白质的新功能都是通过对已有的蛋白骨架进行重新设计进化而来。基于这一进化规律,我们从已有的酶模型出发,在SOD和GPx小肽模拟酶的基础上,在蛋白质二级结构预测软件的辅助下,设计了具有SOD和GPx活性的小肽双功能模拟酶。同时,利用基因融合技术,我们又进一步构建了兼具SOD、GPx和GST活力并可协同作用的三功能抗氧化酶模型。1.设计具有GPx和SOD活力的双功能酶作为机体内的主要抗氧化酶,SOD与GPx不仅在活力上能协同作用,还能组成相互保护的防御群。这种协同对机体的正常代谢至关重要。为促进几种活力的协同,克服以前化学手段得到的模拟物活力低和产物不均一等缺点,我们将SOD和GPx小肽模拟酶连接起来,在其中间插入一个三肽连接物以消除两个小肽结构方面的相互干扰。然后,在蛋白质二级结构模拟软件的辅助下,对该连接物进行了重新设计以模拟SOD和GPx的结构和功能及其协同相互作用。2.设计同时具有SOD、GPx和GST活力的三功能酶我们根据大肠杆菌的最适密码子推导出编码小肽双功能模拟酶的DNA序列,并利用DNA体外重组技术将该DNA序列插入融合表达载体pGEX-2T中GST基因的下游,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行表达。用谷胱甘肽亲和层析柱纯化目的蛋白。在成功地将铜离子和硒氢基引入目的蛋白后,对其进行了活性测定,结果表明该融合蛋白同时具有具有较高的SOD、GPx和GST活力。SOD催化超氧阴离子歧化反应生成过氧化氢(H2O2),GPx催化H2O2还原反应,使其生成水和分子氧,同时,GST催化得轭合反应能修复或促进机体清除已被氧化的生物分子及再生氧化损伤的含巯基蛋白质。这种协同作用不仅能更有效地清除过量的ROS,使其维持在正常水平范围内,还能对被氧化损伤的生物分子进行及时的修复和清理。因此三功能酶在抗氧化方面,具有比单一的抗氧化酶更大的优势。这是第一例利用原核表达的基因工程方法得到的GPx、SOD和GST三功能酶模型。其强大的优势使其有望成为新一代抗氧化药物的有力竞争者。3.设计小肽双功能酶串联多聚体天然抗氧化酶大都是以寡聚体的形式存在,而以往设计的各种抗氧化酶模拟物都是单体结构,这使得其活力远远低于天然酶。在本实验中,为了模拟天然酶的寡聚结构,我们设计了小肽双功能酶的串联多聚体蛋白,在单体多肽之间插入了一或两个凝血酶切位点。这些凝血酶位点作为连接物将几个双功能模拟酶多肽连接在一起,其本身的长度也使得这些单体彼此之间不会因为靠的太紧而相互影响,从而能达到模拟天然酶寡聚结构的目的。值得一提的是,这些寡聚蛋白可以轻易的被凝血酶切为双功能模拟酶单体,从而解决了融合表达小肽后期纯化困难的问题。我们结合使用PCR和酶连接技术构建了串联多聚体小肽双功能酶基因,并将其插入表达载体pPelB中,用IPTG诱导表达。由于pPelB质粒中含有His标签,我们利用镍离子螯合层析柱可以很方便地纯化到目的蛋白。