牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)属于牙本质非胶原蛋白，占牙本质非胶原蛋白的5％～8％，因与骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)相似而得名。DSP富含谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)，由366个氨基酸组成，分子量约为53 000，含30％的碳水化合物和10％的涎酸，有6个潜在的糖基化位点和13个潜在的磷酸化位点。DSP的功能尚不清楚，考虑到DSP在成牙本质细胞中有阳性表达，并在前成釉细胞中有一过性表达，推测DSP可作为成牙本质细胞和相关细胞的标记物，并可能在上皮和间充质之间充当信号分子，参与成牙本质细胞分化。 一、人牙本质涎蛋白的基因克隆、表达、多抗制备和组织表达研究 克隆hDSP成熟肽编码区基因片段并进行原核表达，用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总RNA，再用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA，然后用RT-PCR法，从cDNA中扩增出hDSP基因片段(约600bp)，将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后，挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆；再将hDSP基因重组入表达载体pGEX-3X中构建表达载体，并在大肠杆菌BL21中进行表达。结果酶切图谱和序列分析与文献报道一致，并且hDSP蛋白(约200个氨基酸)在大肠杆菌中得到了高效表达。用原核表达并经过纯化 第囚旱巨大学傅士学位论文 的人牙本质涎蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清，抗血清效价可达1： 100 000。用 Western blot法检测不同组织的表达情况，结果显示 hDSP在人牙 胚中有表达，分子量约为60 000左右，而其它软组织（包括牙龈、肝、肾。 脾等）则无表达，其分子量大小与天然牙本质中DSP的分子量接近。 二、人牙本质涎蛋白全长基因表达载体的构建和莫核细胞转染 用原核系统表达目的蛋白具有产量高、成本低、操作简单等特点，但是原 核系统表达的目的蛋白不具备折叠、糖基化等特点，所以用原核系统表达的目 的蛋白常常不具备天然蛋白的功能。由于hDSP是高度糖基化的糖蛋白，所以， 最好选择真核表达系统。本研究将hDSP全长基因克隆入真核表达载体 pCDNA3中，构建pCDNA3－hDSP重组质粒。酶切鉴定和测序正确后，将 pcDNA3－hDSP真核表达质粒转染COSJ细胞，Western Blot和免疫组化均证 明hDSP在COS刁细胞中得到了较高表达，为其功能研究提供了保障。 三、人牙本质涎蛋白的功能研究 首先，通过免疫组化方法观察了hDSP在人牙胚不同发育阶段的表达情 况。显示hDSP在蕾状期、帽状期成釉器上皮、钟状早期内釉上皮有弱表达， 正在分泌基质的成牙本质细胞、牙本质小管有强阳性表达，而在钟状晚期， hDSP主要在牙本质小管中表达，成牙本质细胞转为弱阳性表达。前成釉细胞、 成釉细胞有一过性表达，而前期牙本质始终无阳性表达，牙胚周围牙槽骨、软 骨和口腔软组织无阳性表达，提示hDSP是牙齿特异性的蛋白，它只在成牙组 织中有表达。另外hDSP在前成釉细胞和成釉细胞中的一过性表达，提示hDSP 不仅参与了牙本质的形成，而且还可能参与了上皮和间质之间的信号传递。再 者前期牙本质阴性表达，表明hDSP蛋白直接通过成牙本质细胞突起穿过前期 牙本质分泌至矿化前沿，参与牙本质的形成。 其次，观察了hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶 活性的影响。选择第5代人牙乳头间充质细胞，通过MTT比色法观察细胞增 殖情况，发现hD盯能明显抑制培养的人牙乳头间充质细胞增殖（P＜0刀1）；通 4 第q罩巨大学俗士学位论X 过检测细胞内和细胞外碱性磷酸酶活性，发现hDSP能明显促进培养的人牙乳 头间充质细胞碱性磷酸酶的分泌（P＜o．01），提示hD SP在人牙乳头间充质细 胞的分化和矿化过程中可能起重要的调节作用。 最后，通过hDSP对狗牙直接盖髓观察hDSP对牙髓损伤修复的影响。选 择体重 10 kg左右、年龄 6～12月的健康杂种狗 3只，选用尖牙、磨牙为实验 牙，共30个。分实验和对照两组：实验组：hDSP表达上清浓缩液加胶原膜， 18个牙；对照组：空白载体表达上清浓缩液加胶原膜和 PBS加胶原膜，各 6 个牙。胶原膜作为载体与实验组、对照组的液体复合，4”C过夜。 结果：hDSP盖髓术后2周，对照组和实验组牙髓组织炎性细胞少见，成 纤维细胞增生明显，实验组和对照组均无牙本质桥形成。随着盖髓时间的延长