世界卫生组织国际癌症研究中心日前公布的研究报告指出到2020年全世界恶性肿瘤发病率将增加50%,全球每年新增恶性肿瘤患者人数将达到1500万人。根据该中心的这份研究报告,目前全世界发病率最高的恶性肿瘤是肺癌,每年新增患者人数为120万。其中非小细胞肺癌占到所有肺癌病例中的80%-85%,包括鳞癌、腺癌、鳞腺癌或腺鳞癌、大细胞癌,小细胞肺癌仅占10%-15%。肺癌在严重威胁着人类的健康和生命,与此同时,人们也一直在寻求积极有效的防治肺癌的手段,化疗一度是治疗非小细胞肺癌的主要手段,但其强烈的毒副反应及局限的疗效使得人们不得不寻求更为有效的治疗方法,21世纪以来,分子靶向药物的出现,尤其是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的临床应用使非小细胞肺癌的治疗取得突破性的进展,然而耐药性的产生使非小细胞肺癌的治疗再次陷入迷途,而目前耐药性产生的机制尚未明确,亦缺乏有效的应对策略。在西医治疗非小细胞肺癌的手段不断发展和突破的同时,中医药在治疗非小细胞肺癌领域也开始崭露头角,在“十五”重点攻关计划和“十一五”科技支撑计划的研究基础上,我们验证了益气除痰方治疗中晚期肺癌能稳定瘤体,延长生存期,并通过基础实验研究发现益气除痰方的抗癌机制与内质网应激反应分子伴侣蛋白相关,而内质网应激反应与肿瘤细胞的耐药密切相关。本课题一方面通过meta分析方法评价中医药治疗非小细胞肺癌的文献研究以期获得中医药治疗非小细胞肺癌的高级别循证医学证据。另一方面通过基础实验研究中医药抑制EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌耐药的机制,对进一步探讨EGFR-TKI耐药机制及寻找应对策略有着积极的意义,同时能丰富中医药的抗癌理论,为中医药临床治疗非小细胞肺癌提供循证医学证据和理论基础。目的：本课题通过实验研究中药基于内质网应激反应分子伴侣机制逆转分子靶向耐药,同时对中医药治疗非小细胞肺癌疗效的临床研究文献进行meta分析,从基础实验和临床研究总结两方面进行探讨,旨在为治疗非小细胞肺癌提供临床综合治疗策略,同时为中医药在非小细胞肺癌中临床应用及基础研究提供思路。方法：一、Meta分析方法分析中医药治疗非小细胞肺癌临床研究文献中医药治疗非小细胞肺癌的系统评价,通过数据库检索2002-2012年期间中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究文献,按照文献纳入标准、排除标准筛选文献,从随机、组间均衡性,纳入排除标准、对照、样本含量、盲法、统计学分析、受试因素标准化、疗效判断标准等方面进行统计分析,并根据Cochrane系统的Jadad量表评价文献质量,在此基础上利用RevMan软件进行meta分析绘制森林图,进行敏感性分析,绘制漏斗图对发表性偏倚进行分析,最后对结果进行分析、讨论。二、实验研究中药基于分子伴侣机制抑制EGFR-TKI耐药1、MTT比色法测益气除痰方含药血清对肺腺癌细胞A549细胞和厄洛替尼耐药肺癌细胞H1650的增殖抑制的影响内质网应激保护反应受损,将最终诱发内质网应激反应性细胞凋亡,益气除痰方能否抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡?含药血清处理各组细胞后,采用MTT法检测药物对细胞抑制率的影响。2、厄洛替尼对耐药细胞H1650的半数抑制率IC50测定。分别用不同浓度的厄洛替尼作用于细胞,MTT比色法测出不同浓度下厄洛替尼对细胞抑制率,并计算出厄洛替尼的半数抑制浓度IC50.3、中药对肺癌分子靶向治疗逆转耐药的作用如果中药对耐药肺癌细胞具有诱导凋亡作用,是否因此增强分子靶向治疗疗效或逆转肺癌耐药呢?在耐药细胞组中加用厄洛替尼和中药血清联合组。通过分析比较两药协同作用的抗癌效果,平行检测分子伴侣表达,细胞抑制率。4、western-blot分析中药对耐药肺癌内质网分子伴侣的影响分子伴侣蛋白的表达和对错配蛋白的修复,是内质网应激反应中的重要环节,也是肿瘤细胞耐药的重要机制。以含药血清作用A549细胞和H1650细胞后,以western blot方法检测分子伴侣CHOP、GRP78/BIP、GADD34的蛋白表达,根据结果分析分子伴侣蛋白与肿瘤细胞耐药的关系,并分析中药对分子伴侣蛋白表达水平的影响。结果：1、中医药治疗NSCLC的meta分析根据纳入标准和排除标准筛选文献,最终共纳入文献14篇。纳入文献中共累计病例1194例,根据修改后的Jadad量表评分(1-3分视为低质量,4-7分视为高质量),其中2篇为4分,5篇为3分,1篇2分,7篇1分。纳入文献研究间的效应量是同质的,治疗组与对照组疾病控制率的OR(比值比)值为1.69,95%可信区间CI=[1.20,2.20],P<0.0001。进行敏感性分析剔除2篇质量较差文献后重新分析支持该结果。2、MTT比色法测厄洛替尼、益气除痰方含药血清及联合对A549及H1650细胞抑制率中药组、厄洛替尼组、联合组分别作用于A549细胞和H1650细胞,均能抑制细胞增殖,并且随着药物浓度的增高,抑制率增加。(P<0.05)；厄洛替尼对A549细胞半数抑制浓度IC50为：7.0μg/ml,对H1650细胞的半数抑制浓度IC50为：47.5μg/ml,联合作用下,厄洛替尼对A549细胞半数抑制浓度IC50为：1.9μg/ml,单用是合用的3.68倍,对H1650细胞的半数抑制浓度IC50为：2.53μg/ml,单用是合用的18.7倍。两者联合作用于A549细胞能增强厄洛替尼的细胞抑制率,与单独厄洛替尼组相比P<0.05.同样中药血清联合不同浓度厄洛替尼作用于H1650细胞能增强厄洛替尼的细胞抑制率,与单独厄洛替尼组相比P<0.05.3、western-blot测分子伴侣CHOP、GRP78/BIP、GADD34的蛋白表达。益气除痰方能下调H1650细胞内质网应激反应分子伴侣蛋白CHOP、GRP78、GADD34的表达,厄洛替尼组的H1650细胞中CHOP表达量1.31,联合组CHOP表达量0.91,均高于A549细胞中CHOP表达量0.89。厄洛替尼组的H1650细胞中GRP78表达量0.91,联合组GRP78表达量0.78,均高于A549细胞中GRP78表达量0.63。厄洛替尼组的H1650细胞中GADD34表达量0.86,联合组GADD34表达量0.70,均高于A549细胞中GADD34表达量0.43。结论：通过对中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究文献进行meta分析结果显示中医药治疗非小细胞肺癌在疾病控制率上优于化疗组(P<0.05),显示出了一定的疗效,尤其体现在瘤体的稳定率方面,与此同时也发现中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究也存在研究设计不规范等诸多问题,这是今后中医药临床研究需要努力的方向。益气除痰方和厄洛替尼均能抑制A549细胞和H1650细胞的增殖,联合作用下益气除痰方能增强厄洛替尼对A549细胞和H1650细胞的增殖抑制率,这种增强作用在H1650细胞更明显。通过western-blot方法检测内质网应激反应中的CHOP、GRP78/BIP、 GADD34的表达显示厄洛替尼耐药细胞H1650细胞中分子伴侣蛋白的表达高于肺腺癌细胞A549细胞,因此内质网应激反应中分子伴侣蛋白表达可能是肿瘤细胞对厄洛替尼耐药的重要机制。益气除痰方能通过下调分子伴侣蛋白表达抑制内质网应激反应从而抑制厄洛替尼耐药,增强H1650细胞对厄洛替尼的敏感性。本研究通过对中医药治疗非小细胞肺癌临床研究的meta分析以及对中药抑制EGFR-TKI耐药的体外细胞研究得出结论,中医药治疗非小细胞肺癌具有一定的疗效,尤其是稳定瘤体方面,同时,基础研究发现内质网应激反应中分子伴侣蛋白表达是肿瘤细胞EGFR-TKI耐药的机制之一,而中医药联合EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌能抑制EGFR-TKI耐药,提高EGFR-TKI疗效,有赖在临床中进行大型随机对照试验加以验证。