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目的:研究证实,藏药蕨麻具有提高机体免疫力、抗氧化、耐缺氧、抗疲劳等广泛生物活性。本课题组前期通过对蕨麻进行化学成分研究及药理活性跟踪发现,野蔷薇苷(Rosamultin)是蕨麻抗缺血、缺氧的活性成分。但目前关于野蔷薇苷(Rosamultin)抗缺血、缺氧作用的信号调控机制尚不清楚。因此,本工作在文献报道及前期研究的基础上,以人脐静脉内皮细胞株EA.hy926为研究对象,建立血管内皮细胞的缺氧性损伤模型,观察野蔷薇苷对缺氧诱导血管内皮细胞钙超载及凋亡的抑制作用,并通过分析钙超载、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)信号通路调控机制及线粒体凋亡通路,探讨野蔷薇苷抗缺氧诱导血管内皮细胞钙超载及凋亡的分子机制。方法:1药物浓度的确定1.1取对数生长期的EA.hy926内皮细胞,随机分为正常对照组,缺氧模型组,以及Rosamultin(1×10-6~1×10-14mol/L)处理组,通过MTT法、LDH活性检测,观察Rosamultin对EA.hy926内皮细胞缺氧性损伤的保护作用,确定实验中Rosamultin的药物浓度。1.2取对数生长期的EA.hy926内皮细胞,随机分为正常对照组,缺氧模型组,以及Verapamil(1×10-6~1×10-14mol/L)处理组,通过MTT法观察Verapamil对EA.hy926内皮细胞缺氧性损伤的保护作用,确定阳性对照药的给药浓度。2 Rosamultin对人EA.hy926内皮细胞缺氧性损伤的保护作用2.1采用流式细胞技术,检测各组EA.hy926内皮细胞的活性氧(ROS)水平,观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞氧化损伤的影响。2.2通过倒置相差显微镜、HE染色,观察Rosamultin对缺氧条件下EA.hy926内皮细胞形态变化的影响。2.3通过台盼蓝染色观察Rosamultin对缺氧条件下EA.hy926内皮细胞存活率的影响3 Rosamultin对人EA.hy926内皮细胞钙超载的抑制作用3.1通过荧光酶标仪,检测各实验组EA.hy926内皮细胞中的钙离子浓度,观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞钙超载的影响。3.2通过激光共聚焦技术,观察Rosamultin对缺氧诱导EA.hy926内皮细胞钙超载的影响。3.3通过免疫印迹(Western Blot)技术,检测各组EA.hy926内皮细胞Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表达水平。4 Rosamultin对人EA.hy926内皮细胞凋亡的抑制作用4.1通过Hochest/PI双染、DAPI染色,从形态上观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞凋亡的影响。4.2通过流式细胞术(Annexin V/PI双染法),检测各组EA.hy926内皮细胞的凋亡率,观察Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞凋亡的影响。4.3通过免疫印迹(Western Blot)技术,检测各组EA.hy926内皮细胞Bax/Bcl-2、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达水平。5采用免疫荧光法,观察各组EA.hy926内皮细胞中HIF-1α的核转位情况,探讨Rosamultin对缺氧诱导血管内皮细胞HIF-1α活化的影响。6通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA),检测各组EA.hy926内皮细胞e NOS以及i NOS的表达水平。采用酶检测试剂盒检测各组EA.hy926内皮细胞NO水平。7通过免疫印迹(Western Blot)技术,检测各组EA.hy926内皮细胞p VHL、HIF-1α、HIF-1β、VEGH蛋白的表达水平。8通过缺氧前加入HIF-1α特异性抑制剂“二甲氧基雌二醇”(2Methoxyestradiol),观察Rosamultin抑制缺氧诱导EA.hy926内皮细胞凋亡的分子机制。结果:1药物浓度的确定1.1 Rosamultin浓度的确定与正常对照组相比,缺氧模型组细胞活力显著下降,1×10-6 mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin处理之后,缺氧条件下细胞活力均显著上升(P<0.01)。其中,Rosamultin在1×10-11 mol/L时其保护作用最显著,且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范围内其作用随浓度降低而趋势。与正常对照组相比,缺氧模型组LDH外漏显著增高,加入1×10-6 mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin处理均可是缺氧导致的内皮细胞LDH外漏减少(P<0.01)。其中,Rosamultin在1×10-11 mol/L时,LDH外漏最少,且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范围内,LDH外漏量随浓度降低而升高。综合MTT及LDH检测结果,确定Rosamultin的高中低浓度分别为1×10-11 mol/L、1×10-12 mol/L、1×10-13 mol/L。1.2 Verapamil浓度的确定与正常对照组相比,缺氧模型组细胞活力显著下降,各浓度Verapamil均能在缺氧条件下显著提高细胞活力(P<0.01)。为了与Rosamultin浓度一致,选取1×10-11 mol/L为Verapamil浓度。2 Rosamultin对内皮细胞缺氧损伤的保护作用2.1细胞内ROS测定结果与正常对照组相比,缺氧模型组细胞内ROS水平明显提高(P<0.01),野蔷薇苷各浓度组(Rosamultin,1×10-11、1×10-12、1×10-13mol/L)均能够明显减少缺氧引起的细胞内ROS堆积,降低细胞内ROS的水平(P<0.01)。2.2细胞形态学检查与正常对照组相比,缺氧模型组细胞皱缩、脱落。Rosamultin处理组和阳性药组细胞形态明显改善。2.3台盼蓝染色结果与正常对照组相比,缺氧模型组蓝染细胞显著增加,细胞存活率下降,而Rosamultin及Verapamil处理组蓝染细胞显著减少,细胞存活率显著升高(P<0.01)。3 Rosamultin对缺氧所致EA.hy926内皮细胞钙超载的影响3.1荧光酶标仪检测结果与正常组相比,细胞内钙离子浓度随着缺氧时间延长而升高,呈时间依赖性。缺氧2h时,与缺氧损伤组相比,Rosamultin及Verapamil处理之后,细胞内钙离子浓度显著降低(P<0.01)。3.2激光共聚焦检测结果细胞内钙离子浓度随着缺氧时间延长而升高,Rosamultin处理之后,细胞中荧光强度显著减弱。3.3钙离子通道及钙蛋白酶Western Blot检测结果细胞内Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表达量随着缺氧时间延长而增高(P<0.01),呈浓度依赖性;缺氧2h后,与正常对照组相比,缺氧模型组细胞内Stim1、Orai1、Calpain1均显著上升(P<0.01),Rosamultin处理之后Stim1、Orai1、Calpain1的表达水平均显著下降(P<0.01)。4 Rosamultin对缺氧所致EA.hy926内皮细胞凋亡的影响4.1 Hochest/PI双染结果与正常对照组相比,缺氧模型组中死亡细胞明显增多,视野中出现大量被红色荧光标记的细胞,染色质凝集增多,而Rosamultin处理之后,死亡细胞明显减少,染色质凝集减弱。4.2 DAPI染色结果与正常对照组相比,缺氧模型组细胞核皱缩,着色加深,能看到明显的棒状凋亡小体,有的细胞胞核膨胀,破碎,而Rosamultin处理后,胞核皱缩的状态明显好转。4.3流式细胞法(Annexin V/PI双染法)结果与正常对照组相比,缺氧模型组中细胞凋亡率显著增加(P<0.01),加入野蔷薇苷(Rosamultin,1×10-11、1×10-12、1×10-13mol/L)和维拉帕米(Verapamil,1×10-11mol/L)干预之后,细胞凋亡率显著下降(P<0.01)。4.4 Rosamultin对凋亡相关蛋白的影响与正常对照组相比,缺氧模型组中细胞内Bax、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量明显增高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.01);在加入Rosamultin处理之后Bax、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bcl-2表达增高(P<0.01)。5细胞内i NOS、e NOS、NO检测5.1 ELISA法检测细胞外i NOS、e NOS含量与正常对照组相比,缺氧模型组中细胞内i NOS水平显著升高(P<0.01),e NOS水平显著降低(P<0.01)。而经过各浓度Rosamultin以及Verapamil处理之后,i NOS的水平显著降低(P<0.01),e NOS的水平显著提高(P<0.01)。5.2分光光度法检测细胞外NO含量与正常对照组相比,缺氧模型组中NO水平显著降低(P<0.01)。而经过各浓度Rosamultin以及Verapamil处理之后,NO的水平显著提高(P<0.01)。6免疫荧光法观察细胞内HIF-1α的核位移结果正常对照组,细胞内HIF-1α表达量很少,细胞中被FITC标记的HIF-1α蛋白极少,荧光微弱,缺氧后细胞内HIF-1α入核并在细胞中大量表达,荧光强度显著增强,加入Rosamultin处理之后,HIF-1α表达显著增加,荧光强度与缺氧组相比显著增强(P<0.01)。7 Rosamultin对缺氧诱导因子(HIF)相关蛋白的作用与正常对照组相比,缺氧模型组HIF-1α和VEGF蛋白表达量明显增加(P<0.01),p VHL表达量减少(P<0.01),HIF-1β表达量无明显变化;加入Rosamultin处理之后HIF-1α、VEGF和p VHL蛋白表达量与缺氧模型组相比均显著增加(P<0.01),HIF-1β蛋白表达无明显变化。8加入HIF-1α特异性抑制剂二甲氧基雌二醇(2Methoxyestradiol,后面简称2ME2)实验结果:8.1 MTT、细胞凋亡染色及流式细胞检测结果与正常对照组相比,2ME2(10μg/L)+Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧组细胞活力明显低于Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧组(P<0.01),但显著高于缺氧模型组和2ME2(10μg/L)+缺氧组(P<0.01),细胞凋亡染色及流式细胞检测凋亡均与MTT结果一致。8.2免疫印迹(Western Blot)结果与正常对照组相比,缺氧模型组HIF-1α、VEGF蛋白显著升高,2ME2(10μg/L)+缺氧组HIF-1α、VEGF蛋白表达明显降低(P<0.01);2ME2(10μg/L)+Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧组与缺氧模型组相比HIF-1α、VEGF蛋白表达显著下调,但VEGF显著高于2ME2(10μg/L)+缺氧组(P<0.01)。结论:1 Rosamultin能明显减轻缺氧诱导内皮细胞钙超载、凋亡,改善细胞形态,提高细胞存活率,对缺氧诱导的细胞损伤有明显的保护作用。2 Rosamultin可能是通过抑制钙池依赖性钙离子通道减轻内皮细胞缺氧性钙超载。3 Rosamultin可能通过抑制线粒体凋亡通路抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡。4 Rosamultin可通过缺氧诱导因子信号通路发挥对内皮细胞缺氧损伤的保护作用。