目的改良原代肝星状细胞(HSCs)提取方法,观察miR-148a诱导大鼠原代HSCs的自噬作用。方法从成年雄性SD大鼠分离出原代HSCs,并对其进行培养与鉴定,包括形态、得率、活力和纯度测定。细胞得率采用血细胞计数器计数法;细胞活力计算采用台盼兰拒染实验;激光共聚焦显微镜检测自发荧光;Desmin免疫细胞化学染色和α-SMA免疫细胞化学染色测定细胞纯度。在原代HSCs转染miR-148a mimic及inhibitor,采用Western Blot检测自噬标志蛋白LC3B及SQSTM1/p62降解;以GFP-LC3与miR-148a共转染原代HSCs,利用激光共聚焦显微镜检测绿色荧光斑点,以确定自噬情况。结果1、原代HSCs的分离、培养与鉴定:初分离的细胞显微镜下观呈圆形,内含大量折光性很强的颗粒,在培养24-48h后贴壁,呈现圆形、纺锤形、多边形;约培养7 d左右,出现局灶性生长;培养14 d左右,细胞开始呈现成纤维细胞外形。每只大鼠细胞得率约为4.2X10~7个/鼠;细胞活力在90%以上;初分离的HSCs在328 nm激发光下可发出蓝绿色荧光;细胞纯度均在90%以上。2、Western blot检测提示:miR-148a mimic可以增加LC3B-II表达、促进LC3B转换和SQSTM1/p62降解,增强自噬;而miR-148a inhibitor则可以减少LC3B-II表达、抑制LC3B转换和SQSTM1/p62降解,减少自噬。3、激光共聚焦显微镜检测绿色荧光斑点提示:与对照组相比,转染miR-148a mimic的细胞组绿色荧光斑点明显增多,促进GFP-LC3荧光蛋白聚集,表明miR-148a mimic可增强自噬;miR-148a inhibitor细胞转染组的绿色荧光斑点明显减少,抑制GFP-LC3荧光蛋白聚集,表明miR-148a inhibitor可抑制自噬。结论1、改良的肝脏二步酶灌注法可简便、经济、高效的分离HSCs细胞。2、MiR-148a可诱导大鼠原代HSCs自噬活性。