真核细胞内蛋白质的降解途径主要有两条：一是溶酶体途径，主要降解膜蛋白和长寿命的蛋白质等。二是泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin-proteasome system, UPS），此系统介导了细胞内80%以上蛋白质的降解，包括异常蛋白质和短寿命的蛋白质等。UPS参与了细胞生命的调节过程，如细胞周期、细胞凋亡、基因表达、炎症、免疫调节、蛋白质质量控制等。研究表明，在许多疾病中，尤其是恶性肿瘤，都发现有蛋白酶体活性的异常改变。因此，在临床应用方面，蛋白酶体抑制剂成为抗肿瘤治疗的重要手段之一。万珂（Velcade，Vel），是首个被美国FDA批准用于临床上治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂，并取得了良好的疗效。但是，一方面，由于复发、耐药的出现；另一方面，由于它的毒副作用，如周围神经病变，血小板低下，胃肠道刺激，乏力以及抑制造血系统、免疫系统，使得Vel的应用受到了限制。由于蛋白酶体存在于机体的各类细胞中，非选择性的蛋白酶体抑制剂对体内细胞的蛋白酶体功能均有一定程度的抑制效应，由此对机体产生严重的毒副作用。因此，我们的研究主要从寻找特异性抑制肿瘤细胞蛋白酶体活性的抑制剂，以降低对机体的毒副作用来解决这一问题。在药物筛选的过程中，我们注意到了藤黄酸（Gambogic acid，GA），一个从藤黄树脂中提取的天然化合物。研究表明，GA具有显著的体内、外抗肿瘤效应，而且副作用很小，尤其对免疫和造血系统的毒性很小，已经被中国的FDA批准用于治疗不同肿瘤的Ⅲ期临床试验。尽管有研究报道，GA抗肿瘤作用的机制可能与抑制转铁蛋白受体，抑制NF-κB信号通路，抑制血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）有关，但是GA抗肿瘤效应的具体机制还未完全明了。因此，明确GA抗肿瘤作用的靶点将具有重要的意义。本课题就GA的作用机制展开了具体的探讨，进行了如下实验：1、 GA间接抑制蛋白酶体的活性实验室前期的研究发现，GA可以与经典蛋白酶体抑制剂Mg132或Mg262联合增敏抑制肿瘤细胞的生长以及诱导肿瘤细胞的死亡。为了进一步探讨这一联合作用的机制，我们通过对泛素化蛋白质的检测，发现GA不仅可以明显的增强蛋白酶体抑制剂Mg132或Mg262引起的泛素化蛋白质的聚集；同时，GA本身也可以剂量依赖性的诱导泛素化蛋白质以及26S蛋白酶体特异性外源性底物-GFPu的聚集增加。但是，发现相同剂量的GA对纯化的20S蛋白酶体糜蛋白酶样（Chymotrypsin-like，CT-like）活性没有影响，只有当GA的浓度高达5μΜ以上时才有部分抑制效应，IC50高达25μΜ左右。从以上结果我们推测，GA本身不是一个直接的蛋白酶体抑制剂。2、计算机模拟预测GA的代谢产物MT1潜在的与20S蛋白酶体β5亚基结合由于GA在细胞上可以显著的抑制细胞的CT-like活性，而对纯化的蛋白酶体活性抑制效应较弱，由此我们推测GA是一个前体药物，它在细胞上所表现的蛋白酶体抑制功能可能是由它的某个或某些代谢产物所产生的。接下来，我们应用计算机模拟预测GA及其代谢产物MT1、MT2与20S蛋白酶体β5亚基的分子对接情况。结果发现只有GA的代谢产物MT1可以和β5亚基结合，具有潜在抑制20S蛋白酶体CT-like活性的作用。3、MT1和CYP2E1负责GA诱导的肿瘤细胞蛋白酶体活性的抑制为了进一步证实MT1的这一直接蛋白酶体抑制作用，我们应用化学合成纯化的MT1直接作用于纯化的20S蛋白酶体，结果发现，MT1对纯化的20S蛋白酶体CT-like活性抑制的IC50约为0.5μΜ，与GA（IC50约为25μΜ）形成鲜明的对比。接着我们在多种肿瘤细胞系中发现了GA主要经过CYP2E1代谢产生MT1之后才具有明显的蛋白酶体抑制作用，应用CYP2E1的抑制剂二乙基二硫氨甲酸（DDC）或者CYP2E1-siRNA可以明显逆转GA介导的蛋白酶体活性的降低。此外，我们还在多种细胞系中检测到CYP2E1的表达具有差异性。4、GA选择性抑制细胞蛋白酶体CT-like的活性接着，我们更进一步在人肝癌细胞系HePG2上，发现DDC也可以部分逆转GA诱导的HePG2细胞蛋白酶体活性的降低。此外，还发现在HePG2细胞上，GA不抑制半胱天冬酶样（Caspase-like）活性，只轻微抑制胰蛋白酶样（Trypsin-like）活性。表明GA在细胞上是选择性抑制CT-like活性的。5、GA与Vel基因表达谱相似有研究报道，在许多肿瘤细胞系中，蛋白酶体抑制可以诱导典型的基因表达谱。接下来，我们的实验应用DNA芯片检测基因表达谱的变化，发现GA不仅与Vel有相似的基因表达谱的改变，也产生了类似的蛋白酶体抑制特定基因。更进一步的确定了GA在细胞上的蛋白酶体抑制作用。6、GA的细胞毒性依赖于其被CYP2E1代谢后所诱导的蛋白酶体活性的抑制接下来，我们研究了GA在细胞上产生的蛋白酶体抑制效应是否决定它的细胞毒性作用。我们发现CYP2E1的抑制剂DDC明显逆转GA引起的蛋白酶体活性的下降之后，也明显的逆转了GA诱导的细胞死亡。进一步的实验发现，应用CYP1A2的抑制剂α-萘黄酮（ANF）则可以明显增加GA介导的泛素化蛋白质的聚集，进而明显的增强GA诱导的细胞死亡。7、下调CYP2E1逆转而下调CYP1A2则增强GA诱导的细胞死亡为了进一步证实GA诱导的细胞死亡取决于它被CYP2E1代谢之后产生的效应，我们应用siRNA的方法分别将CYP2E1和CYP1A2的表达下调。我们观察到了与蛋白酶体抑制相类似的结果，抑制CYP2E1可以明显逆转而抑制CYP1A2则明显增强GA诱导的细胞死亡。这些结果表明，GA诱导的细胞毒性作用依赖于其被CYP2E1代谢生成MT1后所具有的蛋白酶体活性的抑制功能。8、在多发性骨髓瘤细胞中，GA诱导的蛋白酶体活性抑制及细胞毒性作用也可以被DDC逆转由于蛋白酶体抑制剂最初被批准用于临床是用来治疗多发性骨髓瘤疾病的，并且取得了良好的疗效。因此，接下来我们在多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和U266上探讨GA是否也具有显著的蛋白酶体抑制及细胞毒性效应。我们发现，在多发性骨髓瘤细胞上，GA也可以明显诱导蛋白酶体活性的抑制和细胞毒性作用，而且，这些效应同样可以被CYP2E1的抑制剂DDC所逆转。9、GA诱导细胞毒性的机制与内质网应激有关为了进一步明了GA诱导细胞毒性效应的作用机制，我们检测了内质网应激反应相关蛋白的变化。发现GA可以剂量依赖性的引起内质网应激相关蛋白的改变，而且0.75μΜ的GA与50nM的Vel有着类似的内质网应激相关蛋白的变化。表明，GA与Vel类似，蛋白酶体抑制引起的细胞毒性作用与内质网应激反应有关。10、GA在体内延长P388腹水瘤小鼠的生存、抑制H22实体瘤的生长及抑制蛋白酶体的功能为了进一步明确GA的效应，接下来我们对GA的体内抗肿瘤作用进行了研究。我们的实验发现GA可以提高P388腹水瘤小鼠的生存，可以在体内时间依赖性的抑制P388腹水瘤细胞的蛋白酶体活性，以及抑制H22实体瘤的生长。接着，我们发现，GA可以选择性的抑制H22实体瘤的蛋白酶体功能，对肌肉组织没有作用。而GA与Vel，两者都可以抑制肿瘤细胞和肝脏组织的蛋白酶体功能，可以选择性诱导肿瘤组织PARP蛋白的切割，但对肌肉组织没有影响。我们还检测了GA静脉注射小鼠后相关正常组织中的分布情况，结果显示静脉注射后，GA可在肝脏，脾脏以及肌肉组织中被检测到。有研究报道，Vel静脉注射小鼠后，有与GA类似的肝脏、脾脏分布。但是我们发现Vel可以明显的引起脾脏组织泛素化蛋白质的聚集增加，而GA没有这一作用。表明与Vel相比，GA诱导的蛋白酶体抑制作用具有更好的组织选择性。11、GA的C9-C10位双键被破坏后蛋白酶体抑制和细胞毒性作用明显减弱之前国内、外的研究表明，GA产生生物学效应的活性位点是其C9-C10位双键。接下来，我们探讨GA的C9-C10位双键是否完整对GA功能的影响。我们发现GA的C9-C10位双键被破坏后蛋白酶体抑制功能明显减弱，继而引起细胞毒性作用也明显降低。因此GA诱导的细胞毒性效应依赖其C9-C10位双键的完整，而且GA的蛋白酶体抑制作用是其产生细胞毒性效应的前提条件。12、在体外和体内，GA均不降低CYP2E1缺乏的外周血淋巴细胞的生存为了进一步研究CYP2E1在GA介导的蛋白酶体活性的抑制及细胞毒性作用中的重要性，接下来，我们比较了GA与Vel对外周血细胞的影响情况。发现Vel可以明显抑制正常小鼠和正常人外周血细胞的CT-like活性；明显抑制正常人外周血淋巴细胞的生存；显著降低正常小鼠外周血白细胞的数目。而无论在体内还是体外，GA对CYP2E1缺乏的外周血细胞均没有蛋白酶体抑制作用，以及不抑制这类细胞的生存。我们的实验还在小鼠或人的骨髓细胞以及一些肿瘤细胞系中检测了CYP2E1和CYP1A2的分布。发现与肿瘤细胞相比，小鼠的骨髓细胞CYP1A2高表达，CYP2E1则低表达。在正常人骨髓细胞中，CYP1A2和CYP2E1都低表达，而这两者在白血病病人的骨髓细胞中都高表达。表明在正常小鼠和人的骨髓中，都不能很好的代谢GA。13、与正常人细胞相比，GA对白血病病人的肿瘤细胞有着更显著的细胞毒性和蛋白酶体抑制效应最后，我们收集了多例临床标本，更进一步比较了GA和Vel对白血病病人的肿瘤细胞或正常人外周血单个核细胞的影响。结果显示，Vel对白血病病人的肿瘤细胞和正常人外周血单个核细胞都产生明显的蛋白酶体抑制和细胞毒性作用；而GA只对白血病病人的肿瘤细胞有着明显的蛋白酶体抑制及细胞毒性效应，但对正常人外周血细胞的作用比对肿瘤细胞的作用明显减小。表明与Vel相比，GA可以更好的选择性诱导白血病肿瘤细胞蛋白酶体活性的抑制以及细胞毒性作用。结论：（1）GA是一个蛋白酶体抑制剂的前体药物，必须经过细胞内的CYP2E1代谢之后才具有抑制蛋白酶体的功能；（2）GA的蛋白酶体抑制效应是其产生细胞毒性和抗肿瘤作用的前提条件和重要靶点；（3）由于CYP2E1的表达在肿瘤组织中较高而在正常组织中较低，因此，GA诱导的是一种组织特异性的蛋白酶体抑制和细胞毒性作用，应用于肿瘤的治疗中将具有重要的意义。此部分研究内容已经在《Cell reports》上发表，可以为今后GA的临床试验以及临床应用提供重要的理论依据。