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目的:唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是唾液腺恶性肿瘤中最常见的类型之一,其侵袭性极强,临床预后差.腺样囊性癌中的肿瘤性肌上皮细胞(neoplastic myoepithelial cells，NMCs)是该肿瘤主要增生的细胞成分,NMCs合成和分泌蛋白多糖(proteoglycans，PGs),为肿瘤的生长提供微环境,为肿瘤的侵袭、转移等恶性生物学行为提供直接的营养来源和能量. 蛋白多糖(PGs)是一类大分子糖蛋白,是由多糖分子与蛋白质相结合形成的复合物.PGs是基质的主要成分,其生物合成需要在木糖基转移酶(xylosyltransferase,XT)的催化下进行.目前已知的XT有XT-Ⅰ和XT-Ⅱ两种类型.其中XT-Ⅰ是PGs合成的效率-限制阶段中的关键起始酶,对PGs的合成起到了至关重要的作用.而XT-II作为XT-Ⅰ的一个亚型同样参与了PGs的生物合成,两者氨基酸的相似度接近55%. RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种基因沉默技术.它的核心是使外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA进行特异性降解,最终导致转录后相应基因的沉默. 本实验采用RNAi技术,分别沉默XT-Ⅰ基因和XT-Ⅱ基因,阻抑SACC肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖(PGs)合成,比较两种基因沉默后,PGs分泌阻抑的效率. 方法: 1. 构建针对XT-Ⅰ、XT-Ⅱ基因的腺病毒载体（Ad-shRNA-XT-Ⅰ、Ad-shRNA-XT-Ⅱ ).分别转染腺样囊性癌细胞,分为沉默组1 （SACC-83-XT-Ⅰ组)、沉默组2 （SACC-83-XT-Ⅱ组)、空载体组(SACC-83-HK组),以及未转染组(SACC-83组). 2. XT-Ⅰ与XT-Ⅱ基因沉默效率的检测:采用Real-time PCR技术,从mRNA水平检测分别沉默XT-Ⅰ和XT-Ⅱ基因后，SACC-83细胞中XT-Ⅰ和XT-Ⅱ基因的表达. 3. XT-Ⅰ与XT-Ⅱ蛋白抑制率的检测:采用Western blot蛋白印迹法分别检测各组蛋白的抑制率. 4. PGs含量的测定:基因沉默48 h后,使用Blyscan Assay Kit试剂盒进行检测,将测定的SACC-83-XT-Ⅰ细胞,SACC-83-XT-Ⅱ细胞，SACC-83-HK细胞,SACC-83细胞中PGs合成分泌量的改变,进行统计学分析,从而比较各组PGs阻抑的效率. 结果: 1. 腺病毒载体的构建及转染腺样囊性癌细胞 1%琼脂糖凝胶结果及测序结果显示，Ad-shRNA-XT-Ⅰ、Ad-shRNA-XT-Ⅱ目的序列与设计序列完全匹配,表明腺病毒构建成功.腺病毒介导的质粒载体(Ad-shRNA-XT-Ⅰ、Ad-shRNA-XT-Ⅱ)分别转染腺样囊性癌细胞SACC-83，分为沉默组1 （SACC-83-XT-Ⅰ )、沉默组2 (SACC-83-XT-Ⅱ组)、空载体组(SACC-83-HK组)和未转染组(SACC-83组).转染48 h后,沉默组1(SACC-83-XT-Ⅰ组)转染率为91.71%,沉默组2(SACC-83-XT-Ⅱ组)转染率为93.05%;空载体组(SACC-83-HK组)的荧光表达率为94.10%;未转染组(SACC-83组)细胞无荧光表达. 2. Real-time PCR检测XT-Ⅰ、XT-Ⅱ的基因沉默效率 基因转染48 h后，Real-time PCR时实定量检测结果显示:沉默组1 （SACC-83-XT-I组) XT-Ⅰ基因mRNA表达降低64%,沉默组2 (SACC-83-XT-Ⅱ组)XT-Ⅱ基因mRNA表达降低54%,基因沉默组分别与空载体组和未转染组相比具有统计学差异(P<0.05).沉默组1的基因沉默效率大于沉默组2,差别有显著性(P<0.05). 3. Western blot 检测XT-Ⅰ、XT-Ⅱ蛋白含量 Western blot 相对定量分析结果显示:沉默组1(SACC-83-XT-Ⅰ组),空载体组(SACC-83-HK组),未转染组(SACC-83组)中XT-Ⅰ蛋白相对表达量分别为0.34±0.06,0.68±0.16,0.72±0.17.沉默组2(SACC-83-XT-Ⅱ组),空载体组(SACC-83-HK组),未转染组(SACC-83组)中XT-Ⅱ蛋白相对表达量分别为0.49±0.05，0.77±0.09，0.80±0.08.沉默组1 (SACC-83-XT-Ⅰ组)比较未转染组(SACC-83组)XT-Ⅰ蛋白相对表达量降低38%.沉默组2(SACC-83-XT-Ⅱ组)比较未转染组(SACC-83组)XT-Ⅱ蛋白相对表达量降低31%.空载体组未见XT-Ⅰ、XT-Ⅱ蛋白表达明显降低. 4. 腺样囊性癌细胞蛋白多糖合成量检测 BSA标准品测得标准曲线为Y=0.0102X+0.0279(R2=0.9898).根据标准曲线测得细胞转染48 h后,每106细胞分泌蛋白多糖含量为:沉默组1 (SACC-83-XT-I组)68.33±4.75μg;沉默组2(SACC-83-XT-Ⅱ组)86.28±5.67μg;空载体组(SACC-83-HK组)126.58±9.21μg;未转染组(SACC-83组)135.81±10.15μg.两沉默组(SACC-83-XT-Ⅰ、SACC-83-XT-Ⅱ)比较未转染组(SACC-83组)蛋白多糖合成量分别降低49.69%和 36.47%.空载体组(SACC-83-HK组)比较未转染组(SACC-83组)蛋白多糖合成量降低6.79%.单因素方差分析结果显示:两沉默组分别与空载体组、未转染组有统计学差异(P<0.05),沉默组1(SACC-83-XT-Ⅰ组)的降低率大于沉默组2(SACC-83-XT-Ⅱ组),差异有显著性(P<0.05).空载体组和未转染组未见明显差异(P>0.05). 结论: 1. 分别沉默XT-Ⅰ、XT-Ⅱ基因均能有效抑制SACC-83细胞蛋白多糖的生物合成. 2. 沉默XT-Ⅰ基因,阻抑蛋白多糖合成量(49.69%)明显高于沉默XT-Ⅱ基因,阻抑蛋白多糖的合成量(36.47%).