鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1对大鼠糖尿病机械性痛的影响

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目的鸟嘌呤核苷酸转化因子交换蛋白1(exchange protein directly activated by cyclic adenosine monophosphate,Epac1)是疼痛的重要启动因子之一,但Ep ac1是否参与糖尿病机械性痛(diabetic mechanical allodynia,DMA)的发病机制尚不清楚。本研究应用慢病毒介导shRNA抑制Epac1的表达,观察DMA模型大鼠后爪回缩阈值和背根神经节部位Epac1的表达,探讨Epac1在DMA发病机制中的作用。方法32只雄性SD大鼠(体重180-220g)饲养于无特定病原体级动物房中,自由进食、水,适应环境1周,于实验前测定所有大鼠的体重、空腹血糖和后爪回缩阈值。实验步骤如下:(1)制备糖尿病大鼠模型随机选取20只大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素制作糖尿病模型,链脲佐菌素以20mg/ml的浓度溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,大鼠称重按65mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素溶液。其余12只作为正常对照,腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。3天后测量全部大鼠尾静脉血糖值验证糖尿病造模情况,空腹血葡萄糖水平≥13.9mmol/L为糖尿病造模成功。(2)制备DMA大鼠模型在腹腔注射前(0 d)、后3 d、7 d和14 d检测大鼠后爪回缩阈值,若糖尿病模型大鼠14d的后爪回缩阈值与0d相比显著下降且有统计学差异者,即为制备成功的DMA模型大鼠。根据上述方法,共有11只大鼠成功制备为DMA模型。(3)分组12只正常对照大鼠随机分为2组,1组:正常大鼠鞘内注射对照组(n=6),鞘内注射无效shRNA慢病毒,无效shRNA慢病毒不会导致任何细胞的m RNA降解,作为Epac1shRNA慢病毒的阴性对照;2组:正常大鼠鞘内注射组(n=6),鞘内注射Epac1shRNA慢病毒。制备成功11只DMA模型大鼠随机分为2组,3组:DMA鞘内注射对照组(n=5),鞘内注射无效shRNA慢病毒;4组:DMA鞘内注射组(n=6),鞘内注射Epac1shRNA慢病毒。(4)检测后爪回缩阈值变化及mRNA、蛋白表达变化检测大鼠鞘内注射前(0d)、后1d、3d、6d、9d、12d、14d后爪回缩阈值的变化。鞘内注射14天后,1%戊巴比妥钠(65mg/kg)腹腔注射麻醉后取大鼠L4-L6段背根神经节,采用Real Time-PCR、Western-Blot检测4组大鼠背根神经节部位Epac1的mRNA和蛋白表达的情况。结果(1)与正常对照组大鼠(1组,2组)相比,DMA组大鼠(3组,4组)的后爪回缩阈值明显下降,腹腔注射后7d,14d差异有统计学意义(P=0.020,P=0.000)。同时DMA组(3组、4组)与正常对照组(1组、2组)相比Epac1mRNA和蛋白的表达上调(P=0.000,P=0.000)。(2)鞘内注射后14d,DMA鞘内注射组(4组)大鼠后爪回缩阈值上升,显著高于DMA鞘内注射对照组(3组)大鼠,差异有统计学意义(P=0.000),说明Epac1shRNA慢病毒可上调大鼠机械性痛阈值,缓解大鼠糖尿病机械性痛;经析因设计方差分析统计显示,鞘内注射慢病毒组与鞘内注射无效慢病毒组比较,E pac1mRNA和蛋白的表达降低(P=0.000,P=0.020)。结论Epac1在DMA大鼠中表达升高,应用慢病毒介导shRNA抑制Epac1的表达可上调大鼠机械痛阈值,缓解大鼠糖尿病机械性痛。
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