台湾乳白蚁产阿魏酸酯酶共生菌的筛选及其功能基因的克隆与表达

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生物质能源是一种新能源,其与常规化石燃料相比,具有储量丰富、可再生以及环保等特点,生物质能源的开发与利用具有重要的能源战略意义。然而,天然木质纤维素的难降解性极大地限制了其可利用性,高效的生物质能源转化方式对其开发与利用无疑有着重大意义。经过长期的进化和演变,白蚁生物系统凭借其独特的木质纤维素降解酶系及其协调机制对木质纤维素展现出高效转化与利用的功能。其中,阿魏酸酯酶能够打开木质纤维素内相互交联的阿魏酸酯键,修饰充填在纤维素和半纤维素之间木质素,使生物质原料易于降解,在木质纤维素致密结构的解聚过程中发挥了十分重要的作用。因此,本文以台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus)生物系统作为研究对象,从该白蚁肠道系统中分离能够产生阿魏酸酯酶的共生细菌。其主要研究内容包括以下三个方面:①利用平板透明圈法从台湾乳白蚁肠道中筛选能够产生阿魏酸酯酶的细菌;②选择产酶能力较强的菌株,对其产酶条件进行优化;③克隆并异源表达所选高效产酶菌株的阿魏酸酯酶基因。本文主要研究结果归纳如下:  (1)从台湾乳白蚁肠道中成功筛选出六类(A类~F类)可产生阿魏酸酯酶的共生细菌,选择其中一株产阿魏酸酯酶能力较强的菌株(D2)进行后续研究,通过16S rDNA基因序列的比对,确定其为Burkholderia属的一株细菌。  (2)通过对菌株D2的产阿魏酸酯酶条件进行系统优化,明确了该菌株如下的最优产酶条件:碳源阿魏酸乙酯,氮源硫酸铵,菌体接种量5%(v/v),培养基初始pH7.0,产酶温度25℃,产酶时间2天。优化菌株D2产酶条件后发现,其粗酶液对阿魏酸乙酯的酶活提高了6.6倍;对比优化后粗酶液对人工合成模式底物阿魏酸乙酯(EFA)和天然底物去淀粉麦麸(DSWB)的酶活,发现后者酶活约为前者酶活的33倍(测定后者酶活时,需向粗酶液中添加木聚糖酶),说明菌株D2产生的阿魏酸酯酶对天然底物(DSWB)具有更强的水解能力。  (3)利用设计的简并引物,成功的克隆出菌株D2的阿魏酸酯酶基因。目的基因连接至pEASY-E2表达载体,实现了重组阿魏酸酯酶基因在大肠杆菌表达系统中的异源表达。对重组蛋白进行测序,确定其为阿魏酸酯酶。重组蛋白表达产生的粗酶液对阿魏酸乙酯的酶活为2.5mU/ml。
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