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背景和目的膝关节骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是临床上最常见的关节退行性疾病，以软骨进行性退变和软骨下骨重塑为主要特点，是力学和生物学因素共同作用下软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者合成与分解失衡的结果。临床上，膝关节OA表现为关节持续性疼痛、畸形和功能障碍，目前没有可靠药物和治疗手段可延缓其病程，在晚期只能采用全膝关节置换术（Total knee arthroplast,TKA）治疗，是老年人群关节疼痛和致残的主要原因，给患者和及其家庭带来巨大经济负担。正常骨软骨结构从关节面到骨髓腔依次为透明软骨、钙化层和软骨下骨，软骨下骨又包括软骨下骨板和骨小梁。过去对OA的研究主要集中在透明软骨，认为软骨细胞凋亡和软骨基质降解是OA的原发病因。然而，随着对骨软骨结构和功能认识的不断深入，学者们发现透明软骨、钙化层和软骨下骨三者共同构成一个不可分割、相互影响的功能单位，在OA的发病过程中，钙化层和软骨下骨也发生特异性改变，和透明软骨退变密切相关。事实上，自Radin等首次提出软骨下骨硬化可能是软骨退变的始动因素以来，越来越多的研究开始转向软骨下骨。因此，研究钙化层和软骨下骨在膝关节OA病程中的病理改变特点，有助于全面、深刻的认识OA的发病机制，为其预防和治疗提供新的思路。本课题选用骨性关节炎最具代表性的膝关节为研究对象，对TKA术后胫骨平台标本进行研究，综合运用多种染色方法观察透明软骨、钙化层和软骨下骨病理改变特点，并采用骨组织形态计量学方法测量骨软骨结构参数，对比分析内、外侧平台透明软骨、钙化层和软骨下骨结构参数的差异，为进一步研究膝关节OA的发病机制提供实验依据。方法1．标本来源：筛选在第三军医大学西南医院关节外科中心行TKA治疗的30例膝关节OA患者，均伴有内翻畸形，内翻角度1～23°，平均9.3°。术前排除类风湿性关节炎、创伤、感染、肿瘤等其它膝关节疾病。标本均为患者自愿捐赠，其中女19例19膝，男11例11膝，年龄55～78岁，平均65.1岁，病程10～25年，平均16.6年。2．大体观察：TKA术中获取新鲜胫骨平台30个，肉眼观察内、外侧平台软骨颜色、光泽度和外观，观察软骨表面有无软化灶、溃疡、裂隙和血管翳样组织形成，有无软骨下骨暴露、象牙化和骨赘形成等。为避免区域差异，在胫骨内、外侧平台中央负重区分别切取骨软骨组织块，共计60个标本，置于体视显微镜下观察骨软骨纵切面大体形态结构。3．组织学观察：常规制备石蜡切片，采用HE染色、番红O/固绿染色、甲苯胺蓝染色、天狼猩红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察透明软骨、钙化层和软骨下骨的病理改变特点；于番红O/固绿染色下，双盲法参照Mankin评分和OARSI分级标准对软骨退变程度进行分期和分级，对比内、外侧平台软骨Mankin评分差异。4．骨组织形态计量学分析：于番红O/固绿染色下，应用Image-Pro Plus6.0图像分析软件，按照骨组织形态计量学方法测量骨软骨结构参数，对比分析胫骨内、外侧平台透明软骨、钙化层和软骨下骨结构参数的差异。5．统计分析：实验数据采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，两两比较采用配对t检验，检验水准α=0.05。结果1．大体观察：肉眼观察发现内侧平台软骨退变程度较外侧平台更为严重；体视显微镜示透明软骨厚度减小，钙化层和软骨下骨之间界线不清，软骨下骨明显增厚。2．组织学观察：（1）透明软骨：根据软骨Mankin评分结果可将OA病程分为早、中、晚3期。在60个标本中，14个为OA早期，浅表层裂隙形成，且局限于浅表层；19个为OA中期，纵行裂隙进入软骨深层，裂隙周围软骨细胞簇集、增殖；27个为OA晚期，软骨全层缺失，伴血管翳样组织生成。根据OARSI分级可将软骨退变程度分为0～6级。内侧平台软骨Mankin评分为（12.4±1.1）分，显著高于外侧平台的（8.3±1.6）分。（2）钙化层：早期示潮线复制、前移且间隙增宽，伴微裂隙形成；中期示钙化层厚度增加伴血管侵入；晚期示钙化层厚度减小甚至完全缺失，多见软骨内化骨现象。（3）软骨下骨：早期软骨下骨厚度增加；中期软骨下骨厚度明显增加，局部软骨下骨暴露；晚期软骨下骨广泛暴露、象牙化，可伴有血管翳样组织、软骨下骨囊肿和软骨样组织沉积形成。3．骨组织形态计量学分析：内侧平台软骨全层厚度（TAC）和骨小梁间距（Tb.Sp）显著低于外侧平台（P<0.05）；内侧平台ACC/TAC比值、软骨下骨板厚度（SCP）、骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数目（Tb.N）均显著高于外侧平台（P<0.05）；内、外侧平台钙化层厚度（ACC）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论1．在膝关节OA不同时期，透明软骨、钙化层和软骨下骨都发生了典型病理改变。2．在膝关节OA病程中，透明软骨厚度明显减小，软骨下骨板厚度明显增加，而钙化层则可能经历了一个早期厚度增加，中、晚期厚度减小的过程；骨小梁体积分数增加具体表现为骨小梁厚度、数目的增加，而骨小梁间距是减小的。3．钙化层和软骨下骨可能在膝关节OA发病过程中起着重要作用。