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牙周炎是发生在牙齿支持组织的慢性炎症性疾病,以牙龈出血、牙周袋的形成、牙槽骨的吸收为主要临床特征,是成年人牙齿缺失的首要病因,严重危害口腔健康。此外,牙周炎还与全身多种系统性疾病密切相关,影响全身健康[1]。牙周炎治疗的目标是修复牙周缺损,实现牙周组织再生。然而,牙周炎条件下各种细胞的修复、再生能力有限,牙周组织再生目前仍然是一项临床挑战。调节炎症反应,提高炎症微环境下干细胞的再生潜能对于牙周组织再生至关重要。因此,寻找、开发能够调节炎症反应,提高干细胞分化能力,促进牙周组织再生的分子或药物是目前牙周炎临床治疗的热点。研究发现,腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)信号通路在炎症和骨组织代谢过程中均发挥重要的调控作用,通过AMPK信号通路可以调控巨噬细胞介导的炎症反应,促进间充质干细胞的成骨分化,促进牙周组织再生,AMPK是牙周炎治疗的有效靶点。贝派地酸(ETC-1002)是一种AMPK的激动剂,目前用于高胆固醇血症的治疗,鉴于老药新用比开发新药投入少、周期短的优点,本研究拟以AMPK作为牙周炎治疗靶点,将ETC-1002首次用于牙周炎的治疗,并探讨其中的机制。由此设计了以下3个方面的研究工作:(1)ETC-1002对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及相关机制研究。首先通过Real-time PCR和ELISA检测ETC-1002对Pg-LPS诱导的巨噬细胞炎症因子如白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)表达的影响,结果表明ETC-1002抑制Pg-LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的表达,抑制巨噬细胞炎症反应。然后,通过Western blot检测了ETC-1002在炎症和正常状态下对AMPKα磷酸化的影响,结果表明ETC-1002在炎症和正常状态下均促进AMPKα的磷酸化。接下来,为了验证AMPK信号通路在ETC-1002抑制巨噬细胞炎症反应中的作用,阻断AMPK信号通路,应用Real-time PCR和Western blot检测巨噬细胞中炎症因子的表达,结果表明,在AMPK信号通路被阻断后,巨噬细胞炎症因子的表达明显升高,充分证明ETC-1002通过激活AMPK信号通路抑制巨噬细胞的炎症反应。NF-κB信号通路是牙周炎症反应的经典通路,为了阐明AMPK和NF-κB两个信号通路在ETC-1002抑制巨噬细胞炎症中的具体作用关系,我们应用Western blot检测了炎症状态下、ETC-1002作用后及阻断AMPK通路后,NF-κB信号通路相关蛋白IκBα和p65的磷酸化水平。结果发现,Pg-LPS提高了IκBα和p65的磷酸化,激活了NF-κB信号通路;ETC-1002降低了IκBα和p65的磷酸化水平,抑制了炎症状态下NF-κB信号通路的激活;而阻断AMPK通路后,IκBα和p65的磷酸化水平再次升高,ETC-1002对NF-κB信号通路的抑制作用消失。这些研究结果表明ETC-1002促进RAW264.7细胞AMPKα的磷酸化激活,从而负性调节NF-κB信号通路,抑制炎性细胞因子的产生,从而发挥抗炎作用。(2)在炎症及正常状态下ETC-1002对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,r BMSCs)成骨分化的影响及相关机制研究。首先,通过Real-time PCR检测不同浓度ETC-1002作用下,成骨基因Runt相关转录因2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、Osterix(OSX)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和I型胶原(collagen type I,COL1)的表达变化,确定ETC-1002促进r BMSCs成骨分化的有效作用浓度,结果表明,100μM的ETC-1002作用最强。然后,我们通过Real-time PCR检测早期成骨基因的表达,进一步确定在炎症及正常状态下ETC-1002对r BMSCs成骨分化的影响,结果发现,ETC-1002在炎症及正常状态下均可以促进成骨基因的表达。然后,通过ALP染色检测了ALP的表达及活性,表明在炎症及正常状态下ETC-1002均可以提高r BMSCs中ALP的表达和活性。接下来,为了评估ETC-1002的晚期成骨分化能力,我们通过茜素红染色(Alizarin red staining,ARS)检测钙结节的形成,结果表明,在炎症及正常状态下ETC-1002均可以促进r BMSCs中钙结节的形成。最后,我们对ETC-1002促进r BMSCs成骨分化的机制进行了相关研究。分别在炎症及正常状态下,应用AMPK的抑制剂Compound C阻断r BMSCs中的AMPK信号通路,进行Real-time PCR、ALP染色和ARS染色以评估ETC-1002诱导的成骨分化是否受到影响。结果表明,无论在炎症还是在正常状态下,阻断AMPK信号通路后,ETC-1002诱导的r BMSCs成骨因子的表达、ALP的表达及钙结节的形成均受到明显抑制。这充分证明了,无论在炎症还是正常状态下AMPK信号通路均参与了ETC-1002诱导的r BMSCs的成骨分化过程。因此,我们通过这部分实验证明了,无论在炎症还是正常状态下,ETC-1002均可通过激活AMPK信号通路促进r BMSCs的成骨分化。(3)ETC-1002对小鼠实验性牙周炎的作用及相关机制研究。应用C57BL/6小鼠建立实验性牙周炎模型,将其分为牙周炎组、ETC-1002组和Compound C组。十天后,通过检测牙周临床指标发现ETC-1002减小龈沟出血指数和牙齿松动指数,改善小鼠牙周炎症状。为了明确ETC-1002对牙周炎症的影响,我们通过HE染色,观察上颌第一、二磨牙之间牙周组织结构的改变和炎症细胞的数量和分布。结果表明,牙周炎组牙周组织内可见大量炎性细胞浸润,结缔组织附着丧失,牙周纤维排列紊乱,牙槽骨吸收明显;ETC-1002组中少量炎性细胞散在分布,胶原纤维排列较为规则;Compound C阻断AMPK通路后牙周组织再次出现大量淋巴细胞和浆细胞浸润。证明ETC-1002通过AMPK通路发挥抗炎作用。为了进一步验证ETC-1002的抗炎作用,应用Real-time PCR和免疫组化检测牙周组织炎症胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的表达。结果发现,牙周炎组炎症因子表达增高;ETC-1002组炎症因子表达降低;阻断AMPK通路后,炎症因子的表达再次升高。再次证明了ETC-1002通过AMPK通路发挥抗炎作用。为了明确ETC-1002的体内促成骨作用,对上颌右侧第一、二磨牙进行micro-CT扫描,测量并分析釉牙骨质界(CEJ)到牙槽嵴顶(ABC)之间的距离、相关骨及骨小梁参数。结果发现,牙周炎组牙槽骨吸收严重,骨量明显减少,骨矿化密度降低;ETC-1002组牙槽骨的高度、骨量和骨矿化密度均明显增加;阻断AMPK通路后,牙槽骨的高度、骨量和骨矿化密度均再次显著降低。由此说明ETC-1002通过AMPK通路促进牙槽骨再生。为了进一步验证ETC-1002的促成骨分化作用,应用Real-time PCR检测牙周组织成骨相关因子(RUNX2、OSX、COL1、ALP、OCN和OPN)的表达。结果发现牙周炎组成骨因子表达降低;ETC-1002组成骨因子表达增高;阻断AMPK后,成骨因子表达再次降低。再次证明ETC-1002通过AMPK通路发挥促成骨作用。此外,为了观察ETC-1002的体内生物安全性,我们对小鼠的肝、肾、脾和胸腺的组织切片进行HE染色,并检测血液中谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和肌酐的含量。结果显示,与对照组相比,ETC-1002组的细胞形态及血液中AST、ALT和肌酐的含量均未见明显异常,说明ETC-1002体内生物安全性较好。因此,这部分实验证明了ETC-1002在体内发挥抗炎和促成骨作用,并且具有良好的生物安全性。综上,本研究证实ETC-1002可以通过AMPK/NF-κB通路抑制Pg-LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,通过AMPK通路促进炎症及正常状态下r BMSCs的成骨分化。体内实验结果表明,ETC-1002通过AMPK通路抑制小鼠牙周炎症,促进牙槽骨修复、再生。由此可见,ETC-1002通过AMPK在牙周炎中发挥治疗作用,可以作为牙周炎治疗的候选药物,为牙周炎的临床治疗提供新的思路。