Botryosphaeria dothidea是林果树木溃疡类病害的重要病原，研究该病菌的侵染和致病过程可有助于揭示病原与寄主的互作机制。携带gfp基因并高效表达的病菌可有效的实时检测和分析病菌的侵染过程，分离定位致病基因可为研究病菌的致病机制提供理论依据。农杆菌介导技术作为一种高效的转化方法，已经广泛的用于多种真菌的遗传转化，携带外源基因的T-DNA可用于基因修饰和构建随机插入突变体库，进而为研究病菌的致病机制鉴定基础。由于B.dothidea在致病和室内培养过程中均不易产孢，因此，制备高质量的原生质体是该病菌进行gfp基因转化和构建突变体库的首要步骤。本研究通过对酶的种类，酶解液浓度，菌丝年龄，酶解时间，酶解温度和渗透压稳定剂6个可能影响B.dothidea原生质体制备效率的参数进行了分析，结果显示原生质体最大产量产生的条件是菌龄42小时，以1.5％崩溃酶、1.5％葡聚糖酶，在0.7 MNaCl的渗透压稳定剂中酶解3.5小时，最适酶解温度31℃，制备的原生质体在酵母蛋白胨蔗糖培养基(YPS)上再生率最高可达48.33％。　　本研究使用了一个含有潮霉素B磷酸转移酶基因的双元载体pBHt2和我们构建的一个含有潮霉素B磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因的双元载体pKO1-HPH，进行农杆菌介导转化B.dothidea原生质体。转化效率为每105原生质体22个转化子，通过PCR检测、转化子稳定性分析和荧光显微观察，分别实现了两者T-DNA在B.dothidea转化子内的稳定遗传和gfp基因的高效表达，Southern杂交显示转化子拷贝数为一个或者两个。　　Valsa mali var.mali是苹果树等蔷薇科植物腐烂病的病原，目前对于该病菌的控制缺乏行之有效的方法，研究该病菌的侵染和致病过程有助于揭示该病原与寄主的互作机制及致病机制。本研究通过对影响农杆菌介导V.mali var.mali转化过程中的乙酰丁香酮的有无、孢子浓度、共培养时间、共培养温度条件进行了优化探索，建立了一套高效的农杆菌介导V.mali var.mali转化pKO1-HPH，pBHt2的方法，100μl（浓度为1×106个/m1）的孢子液混合100μl经AS诱导的农杆菌，22℃共培养48小时，获得75个转化子。PCR验证了T-DNA成功插入到了病菌的基因组中，转化子的稳定性测定显示插入的T-DNA可以稳定遗传，且gpf能够高效表达，Southern杂交显示转化子中T-DNA均为单拷贝插入。　　本研究首次建立了B.dothidea的原生质体的高效制备方法，同时首次建立了B.dothidea及优化了V.mali var.mali的遗传转化体系，成功获得GFP高效表达的转化子及大量随机插入的T-DNA转化子。为此后开展这两种丝状真菌的侵染，定殖以及其致病基因分离和功能鉴定及病菌的功能基因组学研究奠定了基础。