产气荚膜梭菌是引起畜禽肠胃道疾病的重要病原体,其中A型最常见,危害最严重的类型。它们广泛存在于自然界之中,在动物性产品生产和加工环节能够引发感染,导致人体气性坏疽、食物中毒等,而抗生素的滥用,也导致了严重的耐药问题,而中药作为抗生素优良的替代品,不仅有效抑制细菌病原体生长且经济环保,但目前关于中药不合理应用后,是否会产生耐药性及共耐药的风险尚不清楚,本课题首先检测两种中药单体小檗碱和甘草查尔酮A对A型产气荚膜梭菌的抑菌效果以及与常见抗生素的体外协同抑菌,然后以中药单体诱导前后的菌株进行对比,通过细菌形态,生长能力,生物膜形成能力,以及对其他抗生素共耐药、侧枝敏感及其稳定性等变化,探索可能存在的耐药表型,再结合基因组、转录组和代谢组的分析,探究在中药不合理的应用条件下,A型产气荚膜梭菌产生耐药、交叉耐药及侧枝敏感性的机制。1.中药单体和抗生素对临床A型产气荚膜梭菌的抑菌效果及体外联合抑菌本研究从临床上分离的102株A型产气荚膜梭菌,采用微量肉汤法检测了临床分离菌株对27种抗生素和两种中药单体的敏感性。以MIC90作为两种中药单体对临床分离菌株的耐药判定折点（32μg/m L（BBR）、8μg/m L（LCA））。采用棋盘法,将BBR、LCA分别与常见抗生素进行体外联合抑菌试验。经分析LCA与恩拉霉素（FICI=0.375）,青霉素（FICI=0.375）,利奈唑胺（FICI=0.25）,头孢西丁（FICI=0.5）,多西环素（FICI=0.5）具有一定的协同作用,LCA与泰妙菌素,庆大霉素,克林霉素,阿奇霉素,吉他霉素,杆菌肽,氟苯尼考、替米考星（FICI=0.75）均具有相加作用;BBR与吉他霉素,杆菌肽、头孢西丁与喹烯酮（FICI=0.75）具有相加作用。2.中药单体诱导A型产气荚膜梭菌的侧枝敏感和交叉耐药表型为了得到不同适应/耐药程度的菌株,本研究将试验菌株与BBR、LCA在药物浓度逐渐增加的条件下进行共培养,其中BBR诱导的菌株表现对本身中药单体的耐药性,低倍耐药菌株对头孢噻呋、替米考星、恩拉霉素、喹烯酮交叉耐药,同时对庆大霉素的敏感增高。以及高倍耐药菌株对克林霉素、红霉素、吉他霉素的高倍交叉耐药。对恩拉霉素、多西环素、喹烯酮敏感增高。诱导菌株的细菌形态表现为菌体变长、形状呈不规则状、细胞外质膜疏松。在生长的对数生长期生长速率明显下降,同时生物膜的形成能力下降。LCA诱导的菌株表现对本身中药单体适应性抗性,且容易恢复,低倍耐药菌株对头孢噻呋、喹烯酮、那西肽的产生适应性抗性并随即恢复,对四环素、恩拉霉素、多西环素的敏感性增高,高倍耐药菌株对红霉素、泰妙菌素、吉他霉素、克林霉素产生低倍的交叉耐药,对喹烯酮、四环素、那西肽产生适应性抗性并随即恢复。诱导菌株的形态表现为外膜突起或起泡细胞壁或者细胞膜破裂,形状不规则,菌体发生黏连。其生长能力和生物膜形成能力均没有明显的变化。3.中药单体诱导适应/耐药A型产气荚膜梭菌的基因组测序分析本研究将CVCC2030亲本菌株（A组）vs CVCC2030-BBR-3MIC诱导菌株（B组）、YS5亲本菌株（D组）vs YS5-BBR-8MIC诱导菌株（E组）、CVCC2030亲本菌株（A组）vs CVCC2030-LCA-MIC诱导菌株（C组）、YS1亲本菌株（F组）vs YS1-L CA-7MIC诱导菌株（G组）的基因组数据进行对比分析。分析诱导后耐药基因和毒力基因的变化。关于耐药基因,菌株CVCC-LCA-MIC质粒上四环素的耐药基因te t A（P）、tet B（P）丢失。YS5-BBR-8MIC在染色体上关于林可胺类耐药基因lnu D和四环素耐药基因tet A（P）、tet B（P）发生丢失,但在染色体上出现外排泵基因arl R;在质粒上出现了四环素耐药基因tet A（P）、tet B（P）和大环内酯类耐药基因erm Q。关于毒力基因,菌株CVCC-LCA-MIC质粒上出现bsh毒力基因。菌株YS5-BBR-8MIC毒力基因的数量增多,在染色体上出现毒力基因pfo A、BAS3109、slo;质粒上出现bsh毒力基因。4.中药单体诱导适应/耐药A型产气荚膜梭菌的转录组测序分析将四组菌株的转录组数据进行对比分析。结果显示在A vs B组中表达量发生变化的基因有424个,其中表达量增加的基因有273个,表达量减少的基因有151个;D vs E组表达量发生变化的基因有1121个,表达量增加的基因有479个,表达量减少的基因有642个;A vs C组表达量发生变化的基因有282个,其中表达量增加的基因有165个,表达量减少的基因有117个;F vs G组表达量发生变化的基因有279个,表达量增加的基因有169个,表达量减少的基因有110个。BBR诱导的菌株中关于药物外排和膜转运（mep A、opu CC、TP＿0036、yvg M、ykn V、yvg L）基因的表达量增加;膜蛋白（Mpr F、cls2）、生物膜（lux S、sip W、gene538、gene536）、四环素外排yxa M等基因表达量下降。LCA诱导菌株中与药物外排（mep A、nor M、yis Q、yxa M）、生物膜（abr B、arg G、rib D、rib E、lex A）基因、四环素耐药基因tet P的表达下调;调控23S RNA甲基化（Rlm N、Rlm B、Rlm F、Rlm H、Rlm D）基因的表达上调,这些基因的差异性表达可能与交叉耐药和侧枝敏感有关。同时我们发现BBR诱导的菌株中关于细菌磷酸转移酶系统中相关转运基因（aga C、M6＿Spy0801、man Z、ula C、gene1653、mdx G、yes O）表达量增加。LCA诱导菌株中关于硫胺素代谢的相关基因（thi S、thi E、thi G、thi C、thi D、thi M）的表达量增加,可能与适应性成本所带来的补偿性突变有关。5.中药单体诱导适应/耐药A型产气荚膜梭菌的代谢组测序分析将四组菌株的代谢组数据进行对比分析。结果显示,A vs B和D vs E两组中富集的显著性代谢通路的数量分别是21条、44条。其中有14条两组共富集的代谢通路,主要有蛋白质消化吸收、氨酰和氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的生物合成、矿物质的吸收、氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸、β-丙氨酸和蛋氨酸等）代谢、m TOR信号通路等。低倍耐药菌株中关于ABC外膜蛋白转运、半乳糖的代谢和碳水化合物的消化和吸收的代谢通路以及高倍耐药菌株中关于TCA循环、磷酸转移酶系统（PTS）、糖酵解/糖异生等代谢通路可能与交叉耐药、侧枝敏感和补偿性代谢有关。由LCA处理的A vs C和F vs G两组中富集的显著性代谢通路的数量分别是28条、48条。其中有22条两组共富集的代谢通路,主要有蛋白质消化吸收、氨酰和氨基酸（亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等）的生物合成、矿物质吸收、ABC外膜蛋白转运、氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的降解、氨基酸（β-丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）代谢、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化、碳固定等。ABC外膜蛋白转运、氧化磷酸化以及高倍耐药菌株中出现半乳糖代谢、硫胺素代谢等可能与交叉耐药、侧枝敏感和补偿性代谢有关。