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第一部分ASPP1在结直肠腺癌中的表达及其临床意义的研究
目的:分析结直肠腺癌及对应的癌旁组织中ASPP1的表达水平,探寻肿瘤组织中ASPP1表达与患者临床病理之间的联系。
方法:进行结直肠腺癌组织芯片的IHC分析,综合评价ASPP1在结直肠腺癌和对应的癌旁组织的表达情况,并对组织芯片的染色结果进行评分,统计学分析ASPP1表达情况与患者年龄,性别,肿瘤临床分期,病理分期等的相关性。
结果:根据免疫组化染色评分标准,观察到ASPP1在结直肠腺癌的细胞核和细胞质中表达相较于对应的癌旁正常组织均降低,且结果有统计学差异。根据肿瘤组织中ASPP1的表达情况,我们以中位数作为界线,分为高表达组和低表达组。统计分析了ASPP1表达情况与临床病理特征中的年龄(Age),性别(gender),淋巴结转移(Lymph node),临床分期(Clinical stage),病理分期(Pathological staging),远处转移(Distant metastasis)和Ki67的相关性。结果表明结直肠腺癌的细胞核中ASPP1表达降低,且与高临床分期(P=0.01)和有淋巴结转移(P=0.476)相关。
结论:我们的研究提示在结直肠腺癌中ASPP1表达降低,且ASPP1的低表达与结直肠腺癌的侵袭转移相关。ASPP1可能是结直肠腺癌患者的不良预后因素之一。
第二部分ASPP1与结直肠腺癌的上皮间质转化和侵袭转移的关系的体内外研究
目的:在前一部分的研究的基础上,我们想进一步地研究ASPP1在结直肠腺癌的体内和体外水平对结直肠腺癌的侵袭转移的调控情况。
方法:通过慢病毒转染构建ASPP1下调的稳转结直肠腺癌细胞系。通过进行Transwellinvasion和Transwellmigration实验来研究稳转的细胞系的侵袭转移能力。构建可活化RAS的3D细胞系MCF10AER:HRASV12,利用免疫荧光染色,观察细胞的形态变化。接着,通过对裸鼠尾静脉注射稳转细胞系,建立肺转移的裸鼠模型。运用可见光活体成像技术来研究裸鼠的肺转移情况。用石蜡包埋裸鼠肺组织,进行免疫组化H&E染色,统计裸鼠肺部肿瘤组织占肺面积比。最后,在HCT116细胞系中敲低ASPP1,运用WesternBlot和PCR技术,寻找ASPP1调控的靶基因。构建HKe-3ER:HRASV12细胞系,通过免疫荧光染色,确认靶基因。
结果:通过WesternBlot实验验证,成功构建ASPP1下调的稳转细胞系。根据Transwellinvasion和Transwellmigration实验结果显示,下调ASPP1会明显促进HCT116细胞系的侵袭和转移。成功建立裸鼠尾静脉肺转移模型,在活体成像实验中,实验组相比对照组成瘤明显增加。之后肺组织石蜡包埋进行H&E免疫组化的结果也表明实验组的肿瘤明显大于对照组。通过PCR实验,我们发现在结直肠腺癌细胞系中下调ASPP1,Snail2的表达会增加。运用免疫荧光染色观察到,在Matrigel中培养ASPP1siRNA转染的4-OHT处理的MCF10AER:HRASV12细胞,与单独使用4-OHT处理的细胞相比,它们具有更长的突起,有明显的EMT。
结论:通过体内外层面的实验,我们的结果提示在结直肠腺癌细胞系中下调ASPP1可以促进肿瘤的侵袭转移。在HCT116里成功敲低ASPP1。WesternBlot和PCR结果显示,下调ASPP1后,Snail2明显上调。成功构建HKe-3ER:HRASV12细胞系,并发现下调ASPP1通过Snail2促进结直肠腺癌细胞系的EMT,并且ASPP1可与活化的RAS协同作用更进一步地增加Snail2的表达,从而更加促进EMT。
第三部分ASPP1调控结直肠腺癌侵袭转移的分子机制研究
目的:探究ASPP1调控靶基因的具体途径。
方法:通过TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库,寻找相关的调节途径。运用报告基因和免疫共沉淀的方法探寻并明确ASPP1的分子调节机制。
结果:我们通过分析TCGA数据库发现ASPP1很可能通过NF-κB途径调节Snail2的表达。接着,我们利用了NF-κB报告基因检测发现与对照siRNA组相比,用ASPP1siRNA转染的HCT116中的NF-κB活性明显增加。之后,我们敲低了HCT116细胞中的ASPP1并进行了免疫共沉淀,结果显示ASPP1敲低后NF-κB1p50和p65之间的结合显著增加。最后,我们通过同时敲低ASPP1和p65,同时敲低ASPP1和Snail2,单独敲低ASPP1以及对照组来进行比较,发现单独敲低ASPP1可以诱导HCT116细胞中的EMT,而同时下调Snail2(SNAI2)可以使HCT116细胞的上皮表型得到恢复。同时下调NF-κBp65和ASPP1则可以完全消除Snail2的增加,并恢复了E-cadherin的表达。
结论:在结直肠腺癌中,我们发现下调ASPP1是通过NF-κB途径的活化来上调靶基因Snail2的表达水平,从而促进肿瘤的侵袭转移。
目的:分析结直肠腺癌及对应的癌旁组织中ASPP1的表达水平,探寻肿瘤组织中ASPP1表达与患者临床病理之间的联系。
方法:进行结直肠腺癌组织芯片的IHC分析,综合评价ASPP1在结直肠腺癌和对应的癌旁组织的表达情况,并对组织芯片的染色结果进行评分,统计学分析ASPP1表达情况与患者年龄,性别,肿瘤临床分期,病理分期等的相关性。
结果:根据免疫组化染色评分标准,观察到ASPP1在结直肠腺癌的细胞核和细胞质中表达相较于对应的癌旁正常组织均降低,且结果有统计学差异。根据肿瘤组织中ASPP1的表达情况,我们以中位数作为界线,分为高表达组和低表达组。统计分析了ASPP1表达情况与临床病理特征中的年龄(Age),性别(gender),淋巴结转移(Lymph node),临床分期(Clinical stage),病理分期(Pathological staging),远处转移(Distant metastasis)和Ki67的相关性。结果表明结直肠腺癌的细胞核中ASPP1表达降低,且与高临床分期(P=0.01)和有淋巴结转移(P=0.476)相关。
结论:我们的研究提示在结直肠腺癌中ASPP1表达降低,且ASPP1的低表达与结直肠腺癌的侵袭转移相关。ASPP1可能是结直肠腺癌患者的不良预后因素之一。
第二部分ASPP1与结直肠腺癌的上皮间质转化和侵袭转移的关系的体内外研究
目的:在前一部分的研究的基础上,我们想进一步地研究ASPP1在结直肠腺癌的体内和体外水平对结直肠腺癌的侵袭转移的调控情况。
方法:通过慢病毒转染构建ASPP1下调的稳转结直肠腺癌细胞系。通过进行Transwellinvasion和Transwellmigration实验来研究稳转的细胞系的侵袭转移能力。构建可活化RAS的3D细胞系MCF10AER:HRASV12,利用免疫荧光染色,观察细胞的形态变化。接着,通过对裸鼠尾静脉注射稳转细胞系,建立肺转移的裸鼠模型。运用可见光活体成像技术来研究裸鼠的肺转移情况。用石蜡包埋裸鼠肺组织,进行免疫组化H&E染色,统计裸鼠肺部肿瘤组织占肺面积比。最后,在HCT116细胞系中敲低ASPP1,运用WesternBlot和PCR技术,寻找ASPP1调控的靶基因。构建HKe-3ER:HRASV12细胞系,通过免疫荧光染色,确认靶基因。
结果:通过WesternBlot实验验证,成功构建ASPP1下调的稳转细胞系。根据Transwellinvasion和Transwellmigration实验结果显示,下调ASPP1会明显促进HCT116细胞系的侵袭和转移。成功建立裸鼠尾静脉肺转移模型,在活体成像实验中,实验组相比对照组成瘤明显增加。之后肺组织石蜡包埋进行H&E免疫组化的结果也表明实验组的肿瘤明显大于对照组。通过PCR实验,我们发现在结直肠腺癌细胞系中下调ASPP1,Snail2的表达会增加。运用免疫荧光染色观察到,在Matrigel中培养ASPP1siRNA转染的4-OHT处理的MCF10AER:HRASV12细胞,与单独使用4-OHT处理的细胞相比,它们具有更长的突起,有明显的EMT。
结论:通过体内外层面的实验,我们的结果提示在结直肠腺癌细胞系中下调ASPP1可以促进肿瘤的侵袭转移。在HCT116里成功敲低ASPP1。WesternBlot和PCR结果显示,下调ASPP1后,Snail2明显上调。成功构建HKe-3ER:HRASV12细胞系,并发现下调ASPP1通过Snail2促进结直肠腺癌细胞系的EMT,并且ASPP1可与活化的RAS协同作用更进一步地增加Snail2的表达,从而更加促进EMT。
第三部分ASPP1调控结直肠腺癌侵袭转移的分子机制研究
目的:探究ASPP1调控靶基因的具体途径。
方法:通过TheCancerGenomeAtlas(TCGA)数据库,寻找相关的调节途径。运用报告基因和免疫共沉淀的方法探寻并明确ASPP1的分子调节机制。
结果:我们通过分析TCGA数据库发现ASPP1很可能通过NF-κB途径调节Snail2的表达。接着,我们利用了NF-κB报告基因检测发现与对照siRNA组相比,用ASPP1siRNA转染的HCT116中的NF-κB活性明显增加。之后,我们敲低了HCT116细胞中的ASPP1并进行了免疫共沉淀,结果显示ASPP1敲低后NF-κB1p50和p65之间的结合显著增加。最后,我们通过同时敲低ASPP1和p65,同时敲低ASPP1和Snail2,单独敲低ASPP1以及对照组来进行比较,发现单独敲低ASPP1可以诱导HCT116细胞中的EMT,而同时下调Snail2(SNAI2)可以使HCT116细胞的上皮表型得到恢复。同时下调NF-κBp65和ASPP1则可以完全消除Snail2的增加,并恢复了E-cadherin的表达。
结论:在结直肠腺癌中,我们发现下调ASPP1是通过NF-κB途径的活化来上调靶基因Snail2的表达水平,从而促进肿瘤的侵袭转移。