论文部分内容阅读
本试验目的是研究AdipoQ、AdipoRl和AdipoR2对山羊脂肪沉积的作用机制,为后续通过AdipoQ来调控山羊肌肉中的脂肪酸合成,改善山羊肉品质提供依据。试验克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoRl和AdipoR2基因的全长编码区序列。利用半定量RT-PCR检测3个基因在山羊11个组织(皮下脂肪、背最长肌、股二头肌、腓肠肌、卵巢、子宫、脑、瘤胃、肾脏、肝脏和心脏)中的表达模式。利用qPCR检测AdipoQ、AdipoRl和AdipoR2基因在南江黄羊出生后5个发育阶段(3 d、30 d、60 d、90 d和120 d)背最长肌中mRNA的相对表达量。利用含高浓度葡萄糖的培养基(25 mM/L)诱导山羊骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells, SMSCs)向脂肪细胞分化,油红O染色检测细胞内脂肪滴的沉积,qPCR检测AdipoQ、 AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相关基因的相对表达量。构建AdipoQ基因过表达载体pEGFP-N1-AD,并在山羊SMSCs中过表达AdipoQ基因。荧光显微镜检测融合蛋白的亚细胞定位,qPCR检测AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相关基因的相对表达量。结果如下：(1)克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoRl和AdipoR2基因的CDS区全序列(GenBank登录号分别为JX573539、KC286912和JX573540)。CDS区全长分别为720 bp、1128 bp和1176 bp,编码氨基酸数分别为239、375和391。南江黄羊与人、牛和猪AdipoQ基因核苷酸序列的一致性达到85%、97%和88%；AdipoRl基因核苷酸序列一致性为87%、97%和90%；AdipoR2基因核苷酸序列一致性为86%、97%和88%,表明3个基因在物种间高度保守。(2)半定量RT-PCR检测到AdipoQ基因mRNA在脂肪组织中表达量最高,在肌肉组织和肝脏中表达量相对较低,其它组织中无表达。AdipoR1基因mRNA在所有组织中都有表达,在肌肉组织、瘤胃、脂肪组织中表达量较高,其它组织中表达量较低。AdipoR2基因mRNA同样在所有组织中都有表达,在脂肪组织、肌肉组织中表达量相对较高,在其它组织中表达量较低。3个基因主要在脂肪组织和肌肉组织中表达,表明3个基因在这些组织中起到重要作用。(3)利用qPCR检测南江黄羊背最长肌(3 d、30 d、60 d、90 d和120 d)AdipoQ、 AdipoRl和AdipoR2基因mRNA的相对表达量,发现在南江黄羊公、母羊背最长肌中AdipoQ的表达相似,呈上升-下降-上升趋势,公羊中3 d时表达量最低(P<0.05),120 d时表达量最高(P<0.05)；母羊中3 d时表达量最低(P<0.05),60 d时表达量最高(P<0.05)。AdipoRl在南江黄羊公羊背最长肌中表达趋势为下降-上升,在60 d时表达量最高(P<0.05),90 d时表达量最低(P<0.05)；母羊中表达趋势为下降-上升-下降,在30 d时表达量最低(P<0.05),60 d时表达量最高(P<0.05)。AdipR2在南江黄羊公、母羊背最长肌中表达趋势分别为下降-上升和下降-上升-下降,都是在30 d时表达量最低(P<0.05),90 d时表达量最高(P<0.05)。(4)山羊SMSCs在高糖培养基诱导下合成脂肪酸,油红O染色发现培养6 d后开始出现少量脂肪滴沉积,培养至10 d时细胞内沉积大量脂肪滴,而低糖组无明显脂肪滴沉积。同时qPCR检测到脂肪酸合成及成脂分化相关基因ACC、FAS、 C/EBPα、PPARγ和SREBP-1表达量均显著性升高,表明高糖能上调SMSCs中上述基因的表达,促进脂肪酸合成及向类脂肪细胞转化。在成脂分化过程中AdipoQ、 AdipoR1和AdipoR2表达量也有显著上升,表明AdipoQ及其受体基因可能参与了脂肪酸合成及成脂分化的调控。(5)在山羊SMSCs中过表达AdipoQ基因,发现AdipoQ融合蛋白只在细胞质中表达,表明AdipoQ主要在细胞质中发挥作用。另外qPCR检测发现试验组中ACC、 FAS、SREBP-1、AdipoR2基因表达量显著升高,而AdipoR1、C/FEBPα、PPARγ基因表达量无明显变化,表明AdipoQ能上调ACC、FAS、SREBP-1和AdipoR2基因,促进脂肪酸的合成。