论文部分内容阅读
研究背景糖尿病是以长期血糖水平升高为基本病理改变的代谢紊乱疾病,且伴有多脏器损害。糖尿病血管并发症是糖尿病患者致残、致死的主要原因。研究表明,氧化应激是糖尿病血管并发症的主要机制之一。Src同源区结构域蛋白C(SHC)家族拥有三个成员：ShcA、ShcB和ShcC。ShcA基因编码2种mRNA,翻译3种蛋白,分子量分别为46,52和66kD (p46shcA、p52shcA和p66shcA),前两者由同一种mRNA上的不同启动子翻译。P66shcA是与哺乳动物生命周期相关的蛋白,也是近年来研究细胞氧化应激涉及的主要蛋白之一。研究表明,敲除p66shcA基因可以使小鼠的寿命延长30%,其机制为p66shcA的缺失加强了机体对氧化应激的抵抗。红杉醇(Sequoyitol)在红豆杉科植物中含量丰富,其结构为5-O-甲基-肌醇,具有抗氧化作用。此外,发现红衫醇可明显竞争性抑制α-葡萄糖苷酶活性,同时促进脂肪细胞摄取葡萄糖,而发挥降低血糖作用。本实验将探讨红杉醇对糖尿病大鼠血管内皮的保护作用,其机制是否与p66shcA/活性氧(ROS)信号通路相关。研究方法动物实验：高糖高脂饮食加单次腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)35mg/kg,建立2型糖尿病大鼠模型。实验分为正常对照组、2型糖尿病组、阿卡波糖组(20mg/kg)、红杉醇低剂量组(25mg/kg)、红杉醇高剂量组(50mg/kg)。大鼠连续灌胃给药4周后进行口服葡萄糖耐量(Oral glucose tolerance test, OGTT)实验,取血检测大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG);分离血浆用比色法检测血浆中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量及放射免疫法检测血清胰岛素(Fasting insulin, FIns)含量,计算胰岛素抵抗指数(Insulin resistance, IR)、胰岛素敏感指数(Insulin activity index, IAI)和胰岛素分泌指数(Insulin secretion index, IS); Real time PCR检测大鼠胸主动脉中p66shcA mRNA表达；免疫组织化学方法检测大鼠胸主动脉p66shcA蛋白表达及其磷酸化水平；DHE (Dihydroethidium)染色检测胸主动脉活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平；取胸主动脉观测血管内皮依赖性舒张反应。细胞实验：实验分设正常对照组、高糖组(30mM)、甘露醇组(30mM)、高糖+红杉醇(0.3、1、3μM)组。各药物处理组预孵育人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)1h,再用高糖(30mM)处理HUVECs24h。比色法检测细胞培养液上清中乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase, LDH)释放、Caspase-3活性及细胞中MDA含量；Real time PCR检测细胞中p66shcA mRNA表达；Western Blot检测细胞中p66shcA蛋白表达及其磷酸化水平；DHE染色检测细胞中ROS水平。结果1.与正常对照组比较,糖尿病大鼠FBG、口服糖耐量曲线下面积(Area under curve, AUC)、IR显著升高,FIns、IAI、IS显著减低；红杉醇可显著降低空腹血糖,升高血清中胰岛素水平及改善IS,但对OGTT、IAI无影响。2.与正常对照组比较,糖尿病大鼠胸主动脉p66shcA mRNA和蛋白表达显著上调,同时p66shcA磷酸化水平显著升高；红杉醇能下调p66shcA mRNA和蛋白表达及降低p66shcA磷酸化水平。3.与正常对照组比较,糖尿病大鼠血浆中MDA含量、主动脉中ROS水平显著升高；红杉醇显著降低血浆中MDA含量及主动脉中ROS水平。4.与正常对照组比较,糖尿病大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张反应明显降低；红杉醇显著改善血管内皮舒张功能。5.高糖(30mM)处理HUVECs24h,显著增加LDH漏出和Caspase-3活性；红杉醇(3μM)预孵育1h,抑制LDH释放和Caspase-3活性。6.高糖(30mM)处理HUVECs24h, p66shcA mRNA和蛋白表达显著上调,同时p66shcA磷酸化水平显著升高；红杉醇预孵育1h,能下调p66shcA mRNA和蛋白表达及减低p66shcA磷酸化水平,呈剂量依赖性。7.高糖(30mM)处理HUVECs24h,明显增加细胞中MDA. ROS水平；红杉醇(3μM)预孵育1h,抑制高糖诱导的活性氧生成增加。结论1.红杉醇降低糖尿病大鼠血糖与促进胰岛素分泌有关；2.红杉醇能改善糖尿病大鼠血管内皮舒张功能,其机制与p66shcA/ROS信号通路相关。