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背景及目的: 造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cells Tansplatation，HSCT)目前广泛应用于临床治疗血液系统恶性肿瘤、免疫缺陷病等疾病，由于供体短缺， HLA配型困难，移植前一般需体外大量扩增才可达到移植所需要的细胞量，极大地限制了临床应用。造血干细胞可来源于骨髓(Bone marrow, BM)和外周动员血(Mobilizationof peripheral blood，MPB)，这两种干细胞的来源较为稀缺。脐带血(Cord blood，CB)作为一种新兴的造血干细胞的来源，具有采集简便，HSCs含量丰富，扩增能力强，外源污染少等优点，然而其扩增过程同时伴随干细胞的分化，也是移植失败的重要原因。同时，由于脐带血作为一种稀缺的资源，其供体来源相对来说也比较紧张，且其不能无限量扩增也成为制约其广泛应用的一大瓶颈。2010年，明尼苏达州的一个科研小组报道，芳烃受体拮抗剂StemRegenin1（简称SR1），可使CD34+的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)扩增50多倍，具有移植能力的HSCs扩增17倍，极大的维持了造血干细胞的自我更新能力。 人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESCs)和人类诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)并称为人类多能干细胞(humanpluripotent stem cells，hPSCs)具有无限增殖和多向分化能力的特性。本实验室采用hPSCs与孕10.5天小鼠的主动脉-性腺一中肾(aorta-gonad-mesonephros，AGM)区间充质细胞来源的细胞系共培养，产生像“鹅卵石”一样的细胞，经流式细胞检测表型分析发现，其具有造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells，HSCs/HPCs)的特性，此种血细胞与脐带血来源的CD34+细胞在表观分子上相似，本研究采用细胞生物学和分子生物学的方法验证小分子物质SR1对这种hPSCs分化而来的造血干/祖细胞的扩增作用及其分化潜能。结果发现，SR1对造血干/祖细胞扩增作用效果显著。因此hPSCs来源的HSCs/HPCs可能作为一种HSCs的替代用于移植治疗，这对于再生医学具有非常重要的临床意义。 方法: 1. 将hPSCs细胞与经X射线照射的小鼠主动脉-性腺，中肾区基质细胞系AGM-S3共培养，在造血诱导分化液的诱导培养下，产生大量的“鹅卵石”样(cobblestone-like cells，CS)细胞用于流式分析和免疫学染色等分析。 2. 应用流式细胞术对细胞的表型进行检测，在不同的时间段取样观察细胞表型在扩增过程中的变化，了解细胞的发育和分化过程。 3. 采用组织化学染色技术和免疫荧光技术对胞内外的结构及蛋白表达进行定位和定量，以判断细胞的种类和发育阶段。 4. 采用细胞分选技术，将目的细胞群分离出来，单独的观察小分子物质SR1对该群细胞的作用。 5. 集落培养用来判定SR1对细胞全能性的影响。 6. 悬浮培养检验SR1对特定群体的扩增作用。 7. 采用细胞分选技术将CD34+CD45-和CD34+CD45+的细胞群分选出来，悬浮培养并在培养的各个时间点取样流式分析细胞群体的分化和扩增能力。 荧光定量PCR技术用来检测细胞在不同的发育阶段相关基因的表达及变化情况。 结果: 1. 在hPSCs与AGM-S3共培养14天，在细胞铺开的边缘可产生大量的圆形、折光性强且大小均一的“鹅卵石”样的细胞。 2. 在共培养12天开始加入SR1，发现加入SR1继续培养2天后，共培养细胞群体CD34+、CD34+CD43+、CD34+CD45+的百分比高于对照组，其结果有统计学意义(P＜0.05)。 3. 共培养14天的细胞经胰酶消化，在6因子造血干/祖细胞无血清条件下扩增10天，在扩增的第3、4、5、6、7和10天流式分析。SR1+组CD34+CD45+及CD34+CD43+的细胞群比例明显高于溶剂对照组;两组的细胞扩增总量没有显著性差异，而亚群细胞绝对量在悬浮培养的第4、5天高于对照组，其结果有统计学意义(P＜0.05)。 4. 在集落培养过程中，SR1+组集落总数要明显高于对照组，并且SR1对不同的集落种类刺激作用不同。SR1的作用是持续的，即共培养和集落培养都添加SR1组产生的集落数大于单一时间段添加产生的集落数，两个时点均不添加SR1组产生的集落数最少。 5. 在细胞分选CD34+CD45-和CD34+CD45+群中，SR1+组的细胞扩增能力远远大于溶剂对照组，同时两个亚群扩增过程中CD34+CD45+的百分比也大于对照组。 结论: 1. hPSCs与AGM-S3基质细胞共培养可产生大量HPCs，在14天左右血细胞表面分子标志的百分比达到峰值，其产生的HPCs具有成体造血的特性; 2. SR1对共培养阶段的CD34+、CD34+CD43+和CD34+CD45+细胞群的产生具有明显促进作用(P＜0.05); 3. SR1对悬浮阶段的CD34+、CD34+CD43+和CD34+CD45+细胞群的维持作用明显高于对照组，且可扩增这三个细胞群（P＜0.05）; 4. SR1从两个方面促进成体造血过程:促进生血内皮细胞向造血干/祖细胞分化和维持已有的造血干/祖细胞的未分化状态; 5. SR1具有增强HPCs集落形成的能力，对红系集落刺激作用明显; 6. SR1通过上调造血相关基因及拮抗AHR信号通路调节造血过程。