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目的:骨髓移植是目前许多血液系统疾病唯一可治愈的治疗策略,但如何在体外有效扩增数量有限的造血干细胞(HSC)仍然是当今的研究热点及难点,近年来的研究已经证实了Notch信号和内皮细胞(ECs)在维持HSC池稳态和再生中的重要作用,同时我们之前的研究已表明在体外培养中ECs可促进HSCs增殖。本试验将更深入地探讨ECs促进HSCs增殖是否和Notch信号相关,为体外有效扩增HSCs的深入研究提供理论依据。方法:(1)通过胶原酶消化分离小鼠肺组织,获得的细胞采用EC培养基培养,同时观察细胞的形态,通过免疫荧光染色和流式细胞术鉴定ECs的特性及纯度,当细胞融合至80%左右进行细胞传代培养和共培养。(2)取得的小鼠骨髓通过密度梯度离心法以得到单个核细胞(MNC),采用免疫磁珠分选仪分选出CD117+HSC细胞,采取流式细胞仪测定CD117阳性细胞的纯度及HSC CD117CD34的共表达率。(3)将HSC接种到含或未含ECs的培养基中,分为EC单独培养组、EC+HSC共培养组、HSC单独培养组,每组设置3个复孔,我们前期的研究发现ECs促进HSC增殖于第4天作用最明显,于第7天HSC峰值最高,因此将第4天和第7天作为本实验的时间点。培养第4天和第7天分别采集ECs和HSC样本,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)测定ECs和HSC表面Notch配体、受体及下游靶基因的表达及其表达是否发生改变。结果:(1)小鼠肺微血管经胶原酶消化后,4天时细胞贴壁,大多细胞呈圆形,部分细胞呈串珠样结构相连;培养至第8天,可见细胞聚集成团,大多细胞成短梭形及不规则形,相邻细胞伸出伪足与彼此相连;10天时,可观察到细胞开始表现出“鹅卵石样”形态,细胞融合达70-80%;培养至第14天,细胞逐渐增多,排列紧密,细胞融合达到90%,表现为典型的“鹅卵石样”形态;FACS鉴定ECs,实验结果表明:vWF、CD31、CD34、CD45表达率分别为:81.39%、45.8%、57.48%、0.17%。免疫荧光染色和共聚焦成像结果表明:CD31阳性率为54.5%。(2)应用免疫磁珠分选仪分选的CD117+细胞,存活率为97%,镜下细胞较小,呈圆形;FACS鉴定HSC,实验结果表明CD117+细胞的纯度为99.51%,HSC CD117CD34共表达率为75.28%。(3)分别统计EC+HSC组、HSC组的第4天及第7天的HSC数量,HSC的计数EC+HSC组均高于HSC单独培养组(P<0.05),各组中HSC计数第7天>第4天(P<0.05)。(4)培养第4天及第7天,通过RNA提取试剂盒提取HSC RNA,EC+HSC组HSC的RNA含量均高于HSC单独培养组(P<0.05),各组中HSC的RNA含量第7天>第4天(P<0.05);(5)培养第4天及第7天,用荧光定量PCR法分别检测EC的Jagged-2和HSC的Notch1、Notch2、Hes-1的相对表达量,即RQ值。在第4天和第7天中Jagged-2的RQ值:EC+HSC组均高于EC单独培养组(P<0.05);各组中ECs的Jagged-2第7天均高于第4天(P>0.05)。在第4天和第7天中Notch1的RQ值:EC+HSC组均高于HSC单独培养组(P<0.05);在第4天和第7天中Notch2的RQ值:EC+HSC组均高于HSC单独培养组(P<0.05);在第4天和第7天中Hes-1的RQ值:EC+HSC组均高于HSC单独培养组(P<0.05);且在EC+HSC共培养组中HSC中的Notch1、Notch2、Hes-1在第7天均高于第4天(P<0.05)。结论:1.从肺组织中成功分离培养了微血管内皮细胞;2.采取免疫磁珠分离法成功分离出CD117+HSC;3.成功建立了造血干细胞与内皮细胞的共培养体系,证明了肺微血管内皮细胞可促进造血干细胞的增殖;4.肺微血管内皮细胞促进造血干细胞增殖的作用可能和Notch信号激活有关。