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研究背景和目的：前列腺恶性肿瘤逐年高发,发病率在欧美国家成年男性中已排第一位。国内由于老龄化社会的到来和健康体检的推广,该病的发病率也已连年上升。长期以来,肿瘤血管生成是被认为其获得血液供应的唯一途径,但血管生成可能不是所有肿瘤获得微循环血液供应的唯一机制,某些高度恶性的肿瘤细胞可以模拟内皮依赖性血管(Edothelium dependent vessel, EDV)的形态结构形成一种新的血液供应模式,称之为“血管生成拟态”(Vasculogenic mimicry, VM)。肝癌、PCa、卵巢癌等恶性肿瘤中已报道有VM存在的证据。VM在前列腺癌的发生、发展中发挥着重要作用。VEGF在前列腺癌组织中表达增高,增加血管通透性和刺激新生血管形成,从而给肿瘤细胞供应足够的营养,使其生长、转移等过程能够顺利进行。近来研究发现,VEGF可通过HIF-1α→VEGFα→EphA2→MMPs→Laminin-5γ2→VM路径诱导前列腺肿瘤细胞形成VM,尤其在生殖系肿瘤当中,只有高表达VEGF的细胞才有形成VM的潜能。因此,我们遴选VEGF参与介导形成VM的通路,探讨芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的作用机制。本研究拟分析芪蓝胶囊对VM形成的影响,探讨芪蓝胶囊干预VM形成的作用规律及“量-效”关系。同时我们在3D培养体系中,采用RNAi干扰技术分别沉默VEGF通路上各位点的表达,运用RT-qPCR和Western-blotting技术检测VEGF通路上各点的基因表达及表达产物变化,目的在于探寻芪蓝胶囊在抑制VEGF介导形成前列腺癌VM的通路中的作用位点及其作用机制。研究方法：1.将PC-3细胞冻存管从液氮罐中取出,迅速融化,转移到离心管,加入2mlDMEM/F-12培养液,吹打混匀,离心后弃去上清,加入1ml DMEM/F-12,吹打使细胞混匀,形成单细胞悬液。将制成的悬液转移至25ml细胞培养瓶,加入DMEM/F-12培养基(含10%FBS) 5ml进行细胞传代培养,细胞计数直至获得足够数量的细胞用于实验。培养好的细胞再次通过BeaverNanoTM 3D细胞培养方法进行3D培养,将3D培养的细胞随机分为：空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组设3个复孔。芪蓝胶囊含药血清按10%,5%,2.5%(培养体系体积比)设置高、中、低剂量组给药,不足10%的组别用胎牛血清补足；空白组采用10%大鼠空白血清给药,作用时间48h。最后采用显微镜对培养孔中的细胞VM进行观察。2.PC-3细胞在培养瓶中处于对数生长期时,处理后加DMEM/F-12(含10%FBS)2ml,吹打形成单细胞悬液。按2.5x105细胞/孔的浓度接种,6孔板,混匀后置于37-C,5%CO2培养箱24小时。培养后进行siRNA的转染,转染后的混合物逐滴加入6孔板中混匀,温育6h。开始转染判定,转染率>80%时,进行后续步骤,荧光标记组停止后续步骤。将细胞分组,包括空白对照组、HIF-1α siRNA组、VEGF-α siRNA组、EphA2 siRNA组、芪蓝胶囊(中剂量)组、芪蓝胶囊+HIF-Iα siRNA组、芪蓝胶囊+VEGF-α siRNA组、芪蓝胶囊+EphA2 siRNA组。最后采用RT-qPCR和Western-blotting技术检测VEGF通路上各点的基因表达及表达产物变化。研究结果：1.空白组中细胞增殖明显,可见VM形成的各类表现,芪蓝胶囊低剂量组细胞增殖明显,可见直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的(没有完全封闭)、有分支的彩虹样的通道,但数量较空白组少；中、高剂量组细胞增殖受到抑制,仅见极少量直行通道形成。2.芪蓝胶囊可减少HIF-1α、VEGF-α、MMP-1的基因表达,但对EphA2的基因表达无显著性影响。转染HIF-1α siRNA后,HIF-1α、MMP-1勺基因表达受到明显抑制VEGF-α、EphA2的基因表达未受明显抑制。转染VEGF-α siRNA后,HIF-1α、 VEGF-α的基因表达未受明显抑制,MMP-1、EphA2的基因表达受到明显抑制,转染EphA2 siRNA后,HIF-1α、VEGF-α的基因表达无明显抑制,EphA2.MMP-1的基因表达受到明显抑制。加入芪蓝胶囊的4组均可明显抑制HIF-1α蛋白的表达,加入芪蓝胶囊4组与HIF-1α siRNA、VEGF-α siRNA、EphA2 siRNA组均可抑制VEGF-α蛋白的表达,芪蓝胶囊对EphA2蛋白表达无明显影响。研究结论：1.芪蓝胶囊含药血清可明显抑制体外前列腺癌PC-3细胞3D培养模型中VM的形成,以中、高剂量组的抑制作用更为明显；2.VEGF-α、EphA2、MMP-1之间存在明显的上下游关系,是VM形成的重要上游因子,证实在VM形成的过程中通路VEGF-α→EphA2-MMP-1→VM真实存在。而HIF-1α与VEGF-α、EphA2之间没有明显的抑制关系,可能与上游VEGF-α基因受到其他更多因子调节有关。MMP-1的表达在HIF-1α沉默后受到抑制,提示HIF-1α可能通过其他路径抑制了MMP-1的表达,从而影响VM的形成,还需要进一步深入研究。3.芪蓝胶囊通过抑制HIF-1α、VEGF-α、MMP-1基因以及蛋白的表达,从而使前列腺癌组织中VM形成受到抑制,影响了肿瘤组织自身血液供应系统的生长、发展过程,最终起到治疗前列腺癌的临床作用。