RNA甲基化是细胞内转录后加工过程的一种形式，存在于各种生物体内，与生物合成、信号转导、蛋白修复、染色体调控及基因沉默等均有较大关系。RNA中的这些甲基化修饰主要是通过 S-adenosyl-L-methionone(AdoMet)依赖的甲基转移酶(MTase)来催化的。AdoMet-dependent MTases是酶的一个超家族，能催化RNA、DNA、蛋白质、小分子的甲基基团的硝化、氧化或碳原子的转化。目前，根据其结合AdoMet位点的不同及结合底物的不同，可将MTases分为五种不同的类型(Class Ⅰ-ClassⅤ)，其中以Class Ⅰ为主。1993年，Cheng．X等第一次证实了AdoMet-dependent MTase，它能使DNA胞嘧啶中的第五个碳原子甲基化。随后的研究表明， MTases具有一个高度保守的催化区域，是催化反应得以发生的场所，且最终释放产物，同时，这一结构域对酶结构的稳定性也起着非常重要的作用。 本实验通过从本实验室构建的家蚕cDNA文库中，发现一条长562 bp、ORF为369 bp的家蚕依赖．AdoMet的RNA甲基转移酶基因的cDNA序列，我们将其命名为putative RNA methyltransferase(BmRNAMTase)，GenBank登录号为DQ813500.1。该基因编码122个氨基酸残基，蛋白序列与其他真核生物具有30﹪左右的同源性，预测分子量为13.88kDa。将 PCR 扩增所得RNA MTase基因完整的ORF克隆到pGEM-T-easy载体上，构建了重组质粒，经 Sal Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切后，插入融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点，成功构建重组融合蛋白表达质粒，并转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组成功。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析，在17.1 kDa处有一特异性蛋白条带，与预期值相符，融合蛋白以可溶形式存在。对原核表达蛋白进行超声破碎后，用亲和层析方法纯化蛋白，以纯化好的蛋白作为抗原免疫一只雄性新西兰大白兔获得了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗体效价为1∶51200。Western印迹分析呈阳性并发现在蚕蛹中也有特异性条带，分子量为20kD左右，证实了重组蛋白的表达。免疫荧光细胞定位实验结果表明，RNA MTase大量存在于细胞质中，同时细胞核中也有RNA MTase存在，但量相对较少。 还合成了BmRNAMTase的dsRNA，并转染了家蚕细胞Bm5，通过MTT法测细胞活性，实验结果表明，当双链RNA浓度为6.0μg/ml、干扰72h后细胞活性明显降低。同时，在干扰72h后，用ELISA方法检测细胞中蛋白的表达量，结果表明，RNAi后细胞中的蛋白量明显减少。DNA L,adder实验表明，干扰后死细胞数量增加，但细胞并未发生正常的凋亡现象，推测是干扰后一些非正常因素导致了细胞的死亡。