第一部分中国结直肠癌患者KRAS/BRAF突变及其对西妥单抗疗效的影响　　 研究背景和目标：　　 结直肠癌是威胁人类健康的主要癌症之一。在欧美等国结直肠癌是第3位常见的恶性肿瘤,为癌症死因第2位。结直肠癌的发病率在我国逐年上升,部分地区如上海已上升至第2位。结直肠癌的发病呈上升趋势,但其病死率在下降,这部分获益来源新型细胞毒药物及靶向药物等出现在结直肠癌的药物治疗中发挥的重要作用。　　 西妥昔单抗(Cetuximab,C225,爱必妥)是一种作用于细胞表皮生长因子受体(EGFR)的人鼠嵌合型单抗,研究显示C225单用或与化疗联合对KRAS/BRAF野生型结直肠癌患者疗效肯定,KRAS基因作为西妥昔类单抗治疗结直肠癌疗效的预测分子标记已经明确,BRAF基因得到推荐。但是KRAS/BRAF在中国结直肠癌人群研究并不多,是否存在人种差异?如果拿不到原发肿瘤组织,能否找到替代的检测标本?以上疑问均需要进一步研究去回答。本部分课题研究的主要内容包括:1.探讨中国晚期结直肠癌患者中的KRAS/BRAF基因突变及其与西妥昔单抗疗效的相关性:2.探讨原发肿瘤组织与相匹配血浆中KRAS/BRAF基因突变的吻合度及其临床意义；3.探讨原发肿瘤组织与转移性淋巴结KRAS/BRAF基因突变的吻合度及其临床意义　　 方法与结果：　　 第一章 KRAS/BRAF突变对中国晚期结直肠癌C225联合化疗疗效的影响　　 方法:总结2006年5月至2009年3月期间采用含C225化疗方案的晚期转移性结直肠癌患者81例的疗效,提取部分石蜡组织DNA,通过多聚酶链反应(PCR)和直接测序法分析其KRAS基因12、13密码子突变及BRAF基因600密码子突变情况、突变与治疗有效率(RR)、无疾病进展生存(PFS)和总生存时间(OS)相关性及药物不良反应。　　 结果:81例患者总RR为33.3％,一、二、三线以上使用C225的RR分别为57.1％、38.5％和22.0％。可行KRAS检测44例,KRAS突变20例(45％)；BRAF突变2例(4.5％),为KRAS野生型。44例患者中有43例可评价疗效,其中KRAS突变型和野生型患者的RR分别为5.0％和43.5％(P=0.002)。突变型和野生型KRAS患者中位PFS分别为7.0周、18.6周(P=0.003),中位OS分别为14.8个月和17.5个月,差异无统计学意义(P=0.274)。其中KRAS野生而BRAF突变和野生型病人RR分别为0％和47.6％,中位PFS分别为5.4周和19.9周,差异具有统计学意义(P=0.025),多因素分析KRAS、BRAF突变分别是患者预后不良的两独立预测因素。治疗总体耐受性好,不良反应主要有白细胞减少、恶心呕吐和皮疹,KRAS突变型和野生型患者皮疹的发生率为40％和42％,差异无统计学意义(P=0.91)。　　 第二章原发肿瘤组织及相匹配血浆KRAS/BRAF突变的检测　　 方法:收集从2002年2月至2010年2月在中山大学肿瘤防治中心诊治过的结直肠癌病人中肿瘤组织和相匹配的血浆标本115份,提取血浆及肿瘤组织DNA,通过巢式PCR和直接测序法分析其KRAS基因12、13密码子突变及BRAF基因600突变,Kapa系数检验统计比较肿瘤组织与血浆突变的吻合性。　　 结果:肿瘤组织和血浆BRAF突变率分别为3.5％(4/115)、0.87％(1/115),两者之间没有发现同时出现的突变(K=-0.016)。原发肿瘤组织KRAS突变率为32.2％(37/115),而血浆为11.3％(13/115),37例组织KRAS突变的样品中,相匹配9例血浆样品也同时检测到KRAS突变,两者吻合率24.3％(9/37),统计发现本研究中结直肠癌肿瘤组织和血浆KRAS差异很大(x=7.408,P=0.006),吻合程度低,kappa=0.231,　　 第三章转移淋巴结与原发肿瘤组织KRAS/BRAF突变的检测　　 方法:在第一、二章里有淋巴结转移的结直肠癌病人中,选取我院病理科保存有石蜡标本的45例,同样以PCR和直接测序法分析其KRAS基因12、13密码子突变及BRAF基因600突变,Kapa系数检验统计比较肿瘤组织与转移淋巴结突变的吻合性。　　 结果:45例原发肿瘤组织中KRAS突变率35.6％(16/45),淋巴结转移样品中检测到9例突变,突变率20.0％(9/45),9例转移淋巴结KRAS突变的样品全部属于16例肿瘤组织突变病人中,两者吻合率56.3％(9/16),统计发现本研究中结直肠癌肿瘤组织和转移淋巴结KRAS基因状态中度吻合,K(Kappa)=0.624,P=0.0001。9例淋巴结转移的病人中有7例使用了西妥昔单抗联合化疗,没有1例获得PR或CR,RR为0％。45份肿瘤组织和转移性淋巴结均只有1例BRAF突变,为同一KRAS野生型病人,突变率2.2％(1/45),两者的吻合系数kappa=1.0。BRAF突变的病人对西妥昔单抗联合FOLFIRI治疗无效。　　 结论：　　 1.含C225的化疗方案治疗晚期转移性结直肠癌患者耐受性好,KRAS野生型患者疗效肯定,PFS时间较KRAS突变型患者明显延长；BRAF野生也是结直肠癌病人对C225治疗有效需要的条件。　　 2.中国结直肠癌病人原发肿瘤组织与血浆KRAS/BRAF突变吻合度不高,有一定差异,使用C225前需要考虑差异的存在。　　 3.中国结直肠癌病人原发肿瘤组织与转移淋巴结KRAS突变中度吻合,BRAF突变一致性高,转移淋巴结KRAS/BRAF突变检测也可以预测C225的疗效。　　 第二部分血浆循环microRNA在结直肠癌的诊断和预后价值　　 研究背景和目的：结直肠癌的诊治已经取得了很大的进展,死亡率呈下降趋势。但是还有很多问题不能回答,很难达到真正的个体化治疗。目前在结直肠癌作用明确的标记物有CEA、KRAS、ERCC1、UGT1A1等,但还不够,需要更多的特异性好、易检测的标记物出现。　　 microRNA是一种内源性的非编码RNA(ncRNA),由大约22个碱基组成,在转录后水平控制调控基因表达。microRNA广泛存在于各种生物体中。microRNA在很多肿瘤异常表达,与肿瘤的关系密切,涉及诸多方面,包括肿瘤形成、侵袭转移、分期预后、治疗反应、疗效预测、耐药等。目前在淋巴瘤、前列腺癌、胃癌、结直肠癌患者血浆中检测到肿瘤相关的microRNA,而且microRNA具有较好的稳定性和特异性,可以作为结直肠癌诊断和预后的潜在无创性分子标记。　　 目前尚没有直接从血浆扩增microRNA的研究报道,本研究检测未提取RNA而直接从血浆扩增microRNA,评估血浆microRNA在结直肠癌的临床意义。　　 方法:RT-PCR检测103例结直肠癌病人和37例正常对照血浆中miR-21,miR-221和miR-222的表达水平,选择其中扩增质量好的miRNA进一步研究。免疫组化检测相同病人P53、CEA、ER、PR表达情况,分析所选miRNA表水平与P53、CEA、ER、PR蛋白的相关性及与各临床特征的相关性。　　 结果:标准曲线显示血浆miR-21、miR-221和miR-222样品输入量与CT值在3个数量级范围内具有非常好的线性关系,ROC曲线分析证实血浆miR-221可以作为区分结直肠癌患者和正常对照的潜在分子标记,Kaplan—Meier曲线生存分析发现血浆miR-221表达水平高与结直肠癌病人预后不良明显相关,高血浆miR-221病人总生存明显低于低水平(p<0.05)。免疫组化分析提示miR-221与p53表达有明显的相关性。　　 结论:从血浆直接扩增获得miR-221可以作为结直肠癌诊断和预后的潜在无创性分子标记,miR-221与p53的表达相关.