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背景与目的: 人急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是严重威胁人类健康和生命的最常见的疾病之一,其死亡率高,临床多采用化疗。传统的化疗在杀伤白血病细胞的同时,往往对正常造血组织、免疫细胞等也有较大的破坏作用,从而引起严重感染、出血等并发症,甚至可导致病人死亡。由于目前许多化疗药物的临床治疗效果并不理想且毒副作用大,严重影响患者的生活质量,寻求高效低毒的抗肿瘤药物及治疗方法一直是研究的热点。近年来,在肿瘤研究领域通过体外实验及动物实验发现,一些生物毒素如蛇毒中的细胞毒素能抑制肿瘤细胞增殖,为临床抗肿瘤治疗提供了新的思路。 蛇毒细胞毒素又称为心脏毒素或膜毒素,本课题组从舟山眼镜蛇毒中分离纯化出细胞毒素1(Cytotoxin1,CTX1),该碱性小分子多肽是由60个氨基酸残基组成,分子质量为6698 Da。本课题组的前期研究证实了CTX1对多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用,但其机制还有待于进一步研究。目前有关CTX1的研究除本课题组报道外未见报道,且有关CTX1抗急性白血病作用及机制未见文献报道。 本实验采用2种急性白血病细胞株:人急性粒-单核白血病细胞HL-60和人急性髓系白血病细胞KG1a为实验对象,研究CTX1的抗急性白血病作用及其相关作用机制。 研究内容包括: 1、CTX1对白血病细胞和正常细胞的选择性杀伤作用; 2、CTX1对HL-60和KG1a细胞死亡的影响; 3、蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响; 4、三种抑制剂(Caspase家族广谱抑制剂Z-VAD.fmk、溶酶体组织蛋白酶Cathepsin B抑制剂CA-074 Me、RIP1激酶特异性抑制剂Nec-1)对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响; 5、CTX1对溶酶体膜通透性(LMP)和线粒体膜通透性(MMP)的影响; 实验方法: 1 MTS法 检测CTX1对HL-60细胞相对活力的影响。 2 CASY?-Tecnology细胞计数法 CTX1作用于KG1a细胞后,进行细胞计数并计算细胞相对活力。 3乳酸脱氢酶(LDH)活力测定 4荧光显微术原位观察活细胞培养体系细胞死亡情况(PI染色) 4.1观察CTX1作用于HL-60和KG1a细胞死亡情况 4.2观察Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡情况的影响 5流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后细胞死亡情况 5.1验证CTX1对HL-60和KG1a细胞的影响 5.2检测 CTX1对正常小鼠骨髓单个核细胞(Bone Marrow mononuclear Cell,BMNC)的影响 5.3检测CHX对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响 5.4检测Z-VAD.fmk、CA-074 Me和Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响 5.5线粒体膜电位检测:Rhodamine123染色后检测HL-60和KG1a细胞的荧光强度。 6溶酶体特异性荧光标记 LysoTracker Green DND-26染色后于激光共聚焦显微镜下观察采集照相。 结果: 1 CTX1对白血病细胞和正常细胞相对活力的影响 MTS法和CASY?-Tecnology法检测CTX1对两种白血病细胞HL-60和KG1a均具有抑制作用,半数抑制浓度(IC50)分别为10.182μg/ml和3.311μg/ml,并呈现剂量依赖和时间依赖关系(P<0.05)。与白血病细胞株相比,CTX1对BMNC基本无杀伤作用,以 CTX1浓度为4μg/ml为例,细胞相对活力为(92.93±0.47)%,与对照组(92.03±0.93)%相比无统计学意义(P>0.05,n=3)。说明CTX1对急性白血病细胞株有选择性杀伤作用,且CTX1对HL-60和KG1a的IC50不同,说明CTX1对不同白血病细胞株的抑制作用也具有选择性。 2 CTX1对HL-60和KG1a细胞死亡的影响 2.1流式细胞术检测结果显示,CTX1诱导HL-60和KG1a死亡,且呈现剂量依赖和时间依赖关系;CTX1主要引起细胞发生晚期凋亡和坏死,而早期凋亡均不明显。以CTX1作用于KG1a细胞48h为例,早期凋亡率为(0.40±0.10)%,而晚期凋亡和坏死为(63.87±3.73)%。 2.2荧光显微术原位观察细胞死亡情况:对照组的绝大部分HL-60和KG1a细胞形态正常、胞膜光滑完整,未被PI染色。随着CTX1浓度的增加,PI红染的细胞数(即死亡细胞数)明显增多。 2.3随着CTX1浓度增加,KG1a细胞培养体系中LDH活力逐渐增加。 3 CHX对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响 流式结果显示CTX1浓度为8μg/ml、12μg/ml和3μg/ml和4μg/ml分别作用于HL-60和KG1a细胞,作用时间分别为12h和36h时的细胞存活率分别为(64.43±9.46)、(40.37±11.63)和(64.90±3.57)、(57.97±2.14),CTX1主要引起HL-60和KG1a细胞发生晚期凋亡和坏死;经CHX作用后的细胞存活率分别为(84.80±0.50)、(81.57±9.53)和(80.83±3.84)、(76.23±3.98),CHX阻断组与CTX1单独组相比有显著性差异(P<0.01)。CHX能够明显逆转CTX1诱导的HL-60和KG1a细胞死亡,说明CTX1引起HL-60和KG1a细胞的死亡是一种诱导性死亡。 4三种抑制剂Z-VAD.fmk、CA-074 Me和Nec-1对CTX1诱导HL-60和KG1a细胞死亡的影响 4.1应用Z-VAD.fmk或CA-074 Me预处理细胞1小时,再用CTX1(8μg/ml、12μg/ml)处理HL-60细胞12 h,用CTX1(3μg/ml、4μg/ml)处理KG1a细胞24 h,流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后HL-60和KG1a细胞死亡情况,结果显示:Z-VAD.fmk可减轻CTX1作用后的HL-60和KG1a细胞的死亡,以KG1a细胞为例,应用Z-VAD.fmk后,细胞死亡数由(39.20±1.71)%降至(34.23±3.98)%,且具有统计学意义(p<0.05)。应用CA-074 Me可明显减轻CTX1作用后HL-60细胞的死亡,而对KG1a细胞的逆转作用不明显。 4.2用Nec-1预处理HL-60和KG1a细胞12h,再加入CTX1分别作用于HL-60细胞12h和KG1a细胞24h,流式结果显示CTX1(8μg/ml和12μg/ml)作用12h时的细胞存活率为(51.7±1.31)和(38.27±2.15),经Nec-1作用后的细胞存活率分别为(74.20±3.85)和(70.97±10.10),与CTX1单独组相比有显著性差异(P<0.01)。结果表明CTX1诱导的HL-60细胞死亡能够显著被Nec-1逆转,说明CTX1诱导HL-60细胞死亡的机制为一种Caspase非依赖的新的死亡方式,即Necroptosis。而Nec-1不能逆转CTX1诱导的KG1a细胞死亡,说明CTX1导致KG1a细胞的死亡不是通过Necroptosis途径进行的。 5 CTX1对HL-60和KG1a细胞LMP和MMP的影响 5.1 CTX1对LMP的影响:溶酶体特异性染色后,应用激光共聚焦显微镜可见,CTX1浓度为8μg/ml、12μg/ml作用于HL-60细胞12h和CTX1浓度为2μg/ml、4μg/ml作用于KG1a细胞48h后,HL-60和KG1a细胞荧光强度较阴性对照组均减弱,且二者都是随着CTX1浓度的增加,细胞荧光强度逐渐减弱,反映了溶酶体膜完整性丢失,CTX1诱导LMP增加。 5.2 CTX1对MMP的影响:HL-60和KG1a细胞经罗丹明123染色后用流式细胞仪检测。CTX1(4、8、12μg/ml)作用于HL-60细胞12h,低浓度处理组(4μg/ml)荧光强度较对照组无明显变化,CTX1高浓度组(12μg/ml)与对照组相比荧光强度减弱。而CTX1(2、3、4μg/ml)作用于KG1a细胞24h,处理组荧光强度较对照组明显减弱,且带有低荧光强度细胞所占百分率随着CTX1剂量的增加而增加。 结论: 1 CTX1对急性白血病细胞HL-60和KG1a细胞具有选择性杀伤作用,并且该作用呈现剂量依赖和时间依赖关系。 2 CTX1导致HL-60和KG1a细胞的死亡为诱导性死亡。 3 CTX1能够诱导HL-60细胞发生Necroptosis,可能的的机制包括RIP1的激活以及溶酶体膜的通透化;CTX1导致KG1a细胞死亡的机制可能与线粒体膜通透性增加和溶酶体通透化有关。