碱性磷酸酶(ALP)是一种单脂磷酸水解酶，它本身是一种膜结合金属糖蛋白，由两个亚单位组成，有众多的催化底物和复杂功能，除了少数植物外，广泛分布于大多数生物体内。ALP由一个多基因家族编码，目前人和老鼠的碱性磷酸酶基因均已被克隆。人肠特异性碱性磷酸酶基因(IAP)作为甲状腺激素受体的下游靶基因，受甲状腺激素T3的正向调控。甲状腺激素是多效性因子，在鱼类变态中，对其发育和生理功能等多方面起着非常重要的作用。　　 与哺乳动物研究相比，水生动物ALP的研究较多的集中于组织学、酶的生化性质等方面，关于鱼类变态过程中ALP的表达和调控的报道还不多。近几年，本实验室围绕ALP进行了一系列的研究，研究表明，ALP的表达与变态中的形态与功能变化有密切关系，且在牙鲆仔鱼变态中期添加外源性甲状腺素T4可以有效上调ALP表达。本实验室还克隆了ALP的全基因，根据其结构特征及mRNA的组织分布特点，认为克隆的牙鲆ALP属于组织非特异性ALP，利用生物信息学对ALP的5调控区及第一内含子进行分析发现5’调控区存在一个视黄酸应答元件/甲状腺索应答元件(RARE/TRE)，第一个内含子存在两个潜在的启动子位点和一个增强子，含有视黄酸受体(RXR)等转录因子结合位点。并进一步构建报告基因表达载体，通过脂质体方法转染COS-7细胞，检测了5’调控区和第一内含子的启动子活性。　　 为了更深入确定5调控区和第一内含子两个调控序列的功能，本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5’调控区序列、第一内含子序列、5调控区-882～-107bp序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中，分别构建成重组载体pAcGFP1-5ALP、pAcGFP1-Intronl及pAcGFP1-NTR，并将第一内含子插入已构建好的重组载体pAcGFP1-5ALP中，构建成含5调控区和第一内含子调控序列的顺序串联型的报告基因表达载体pAcGFP1-AI。而后通过脂质体介导重组质粒分别转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。结果发现，24h后在倒置荧光显微镜下可看到转染不同重组质粒的孔板细胞发出不同强度的绿色荧光信号，其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强；48h后可以看出荧光信号随时间的延长而增强。结果表明，牙鲆碱性磷酸酶基因5调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性，第一内含子与5’调控区存在协同效应，两者协同能增强基因的表达。　　 为了解甲状腺激素及维甲酸对牙鲆碱性磷酸酶调控序列启动子活性的调节作用，转染CHO细胞24h时，在转染了四种重组质粒的孔板中分别都加入0、50、75和100nM4个不同终浓度的甲状腺激素T3、甲状腺素T4或0、10、50、100nM终浓度的全反式视黄酸(ATRA),24h后再次进行观测。结果发现，随着T3及ATRA处理浓度逐渐增高，转染pAcGFP1-5ALP、pAcGFP1-Intronl及pAcGFP1-AI报告基因表达载体的细胞的绿色荧光强度逐渐增强，而T4处理后的转染细胞的荧光强度没有变化。该结果表明，甲状腺激素T3、全反式视黄酸均可正向调控牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性，甲状腺T4对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性的调节作用并不明显。　　 另对转染报告基因表达载体pAcGFP1-NTR细胞的药物处理结果分析发现，不同浓度ATRA处理对转染细胞的荧光强度没有影响，而T3、T4对转染细胞荧光强度的调节不与处理浓度相关。结果表明，5’调控区-882～-107bp序列不含应答维甲酸的调控元件。　　 以上实验结果为今后进一步研究碱性磷酸酶基因转录表达调控以及甲状腺激素与其之间的调控关系提供了实验依据。