[目的]利用pRNA分子结构特性,以及分子生物学、生物化学与免疫学技术,体外转录合成与制备pRNA、嵌合pRNA/siRNA纳米颗粒,以folate标记pRNA (folate-pRNA)作为靶向分子,带有siRNA的pRNA即pRNA/siRNA作为效应分子,在特定pH和镁离子存在的条件下,体外将folate-pRNA与嵌合pRNA/siRNA单体混合形成folate-pRNA & pRNA/siRNA二聚体,制备由folate-pRNA介导的、带有靶向基因沉默作用的pRNA二聚体纳米靶向基因沉默颗粒。通过肿瘤细胞模型,采用Real-time PCR、western blot检测靶向pRNA/siRNA基因沉默效应,FCM检测靶向pRNA/siRNA诱导肿瘤细胞凋亡效应。为提高pRNA及pRNA/siRNA的稳定性,在体外转录过程中分别引入2’-F或2’-NH2修饰的dCTP和／或dUTP,或者2’-O-Me修饰的CTP和／或UTP,化学修饰pRNA,并分别检测修饰后pRNA的正确折叠和二聚体组装情况、病毒包装活性、抵抗核酸酶降解能力,选择既能够提高pRNA抵抗降解能力又保证pRNA正确折叠以及病毒包装活性的化学修饰方法。基于上述实验,采用2’-F-dCTP和2’-F-dUTP共同修饰嵌合pRNA/siRNA,检测修饰后pRNA/siRNA的二聚体组装活性、体外基因沉默活性,并通过重组Dicer酶切分析、血清学稳定性测定等,评价2’-F修饰对嵌合pRNA/siRNA生物学功能的影响,为体内靶向沉默基因表达与效应研究奠定基础。[方法]1. Folate-pRNA及嵌合pRNA/siRNA纳米颗粒的制备与鉴定利用叶酸结合的腺苷单磷酸(folate-conjugated-AMP, folate-AMP),在体外转录合成过程中,对pRNA的5’端进行末端标记,形成folate-pRNA单体,其与folate受体阳性细胞结合活性已在前期工作中得到证实。同样,通过体外转录,将针对绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和survivin的siRNA序列分别引入pRNA分子,构建合成嵌合pRNA/siRNA (GFP)、pRNA/siRNA (luciferase)、pRNA/siRNA (survivin)单体,采用变性及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别鉴定嵌合pRNA/siRNA分子大小及二聚体自我组装活性。体外分别将folate-pRNA与pRNA/siRNA (GFP)、pRNA/siRNA (luciferase)、或pRNA/siRNA (survivin)混合,使之在含有5 mM Mg2+反应体系自我组装成二聚体纳米颗粒folate-pRNA & pRNA/siRNA。2.靶向二聚体folate-pRNA & pRNA/siRNA纳米颗粒沉默基因效应测定Folate-pRNA靶向pRNA/siRNA沉默基因效应测定：将上述制备的三种folate-pRNA & pRNA/siRNA二聚体纳米颗粒,分别与MCF-7和Hela细胞孵育,通过Real-time PCR、western blot检测细胞内survivin mRNA与蛋白表达,评价pRNA/siRNA沉默基因效应；通过双萤光素酶报告检测系统测定萤光素酶的活性；流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测GFP的表达靶向pRNA/siRNA诱导肿瘤细胞凋亡效应。3.2’-氧甲基(2’-O-methyl,2’-O-Me)修饰,2’-氨基(2’-amine, 2’-NH2)修饰以及2’-氟(2’-fluoro,2’-F)修饰pRNA体外转录pRNA,分别引入2’-fluoro (2’-F)或2’-amino (2’-NH2)修饰的dCTP和/或dUTP,或2’-O-methyl (2’-O-Me)修饰的CTP和/或UTP,获得2’-氟修饰pRNA (2’-fluoro modified pRNA即2’-F pRNA),2’-氨基修饰pRNA (2’-amino modified pRNA即2’-NH2 pRNA)以及2’-氧甲基修饰pRNA (2’-O-methyl modified pRNA,2’-O-Me pRNA)。采用变性及非变性凝胶电泳鉴定上述化学修饰pRNA分子大小和体外二聚体自我组装活性；体外phi29 DNA病毒包装系统测定上述化学修饰pRNA病毒包装活性；与RNase A或FBS共孵育,测定其血清学稳定性等。4.2’-F修饰pRNA/siRNA体外转录引入siRNA序列,同时引入2’-F-dCTP和2’-F-dUTP,制备具有抗降解能力的2’-F修饰嵌合pRNA/siRNA(GFP),即2’-F pRNA/siRNA (GFP)。采用变性及非变性凝胶电泳鉴定2’-F pRNA/siRNA (GFP)分子大小和体外二聚体自我组装活性,体外基因沉默活性,以及体外Dicer酶切鉴定2’-FpRNA/siRNA (GFP)体内释放siRNA能力；体外与含10% FBS的RPMI-1640培养基共孵育,测定其血清学稳定性等。[结果]1.体外folate-pRNA与pRNA/siRNA二聚体的组装利用pRNA结构特性,将针对GFP、luciferase以及survivin的siRNA分子分别构建至pRNA分子中,形成嵌合体pRNA/siRNA (GFP)、pRNA/siRNA (luciferase),或pRNA/siRNA (survivin),非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果可见此三种嵌合pRNA/siRNA均和与之互补的未修饰pRNA形成二聚体条带,其分子大小与由两个未修饰pRNA通过分子间互补作用形成的二聚体近似,表明嵌合pRNA/siRNA单体可与相应pRNA单体通过手拉手互补作用,形成二聚体,证明嵌合pRNA/siRNA二级结构正确折叠并保留自我组装二聚体功能。用folate-pRNA与pRNA/siRNA(GFP)、pRNA/siRNA (luciferase),或pRNA/siRNA (survivin)形成靶向二聚体纳米颗粒,因而通过细胞水平实验检测folate将含有siRNA的pRNA靶向二聚体颗粒导入细胞发挥基因沉默效应的能力。2.靶向folate-pRNA & pRNA/siRNA二聚体纳米颗粒特异性沉默基因效应folate-pRNA & pRNA/siRNA (GFP)二聚体特异性沉默基因效应：含folate-pRNA和pRNA/siRNA (GFP)二聚体分别与转染表达GFP的MCF-7和Hela细胞共孵育,荧光倒置显微镜观察和FCM分析结果表明,folate-pRNA & pRNA/siRNA (GFP)二聚体可显著抑制GFP的表达(8.43%±1.13 and 10.43%±3.01),与对照不含folate的pRNA与嵌合pRNA/siRNA (GFP)形成的二聚体比较有显著性差异(P<0.01)。而不含folate标记的pRNA与pRNA/siRNA (GFP)形成的二聚体,以及单独pRNA/siRNA处理组之间比较(51.78%±5.58和49.78%±4.78),GFP的表达无显著性差异(P>0.05)。结果提示folate受体介导的带有siRNA (GFP)的pRNA二聚体纳米颗粒可由folate受体内吞进入细胞沉默GFP的表达。folate-pRNA & pRNA/siRNA (luciferase)二聚体特异性沉默基因效应：folate-pRNA & pRNA/siRNA (luciferase)二聚体分别作用于转染有表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的质粒pGL3以及表达海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的质粒pRL-TK的MCF-7和Hela细胞,双萤光素酶报告检测系统测定萤光素酶的活性结果表明,此二聚体能显著抑制细胞萤火虫萤光素酶的活性,而对海肾荧光素酶表达无影响。folate-pRNA&pRNA/siRNA (survivin)二聚体特异性沉默基因效应：靶向folate-pRNA和pRNA/siRNA (survivin)二聚体纳米颗粒分别与MCF-7和Hela细胞共孵育,Real-time PCR结果显示嵌合folate-pRNA和pRNA/siRNA (survivin)二聚体可显著降低survivin mRNA的表达,表达率分别相当于不含folate标记的pRNA/siRNA (survivin)单体对照处理组的18.73%±1.21和16.74%±2.03；western blot结果显示,folate-pRNA & pRNA/siRNA (survivin)二聚体可显著抑制survivin蛋白的表达；Annexin V-FITC/PI双染FCM分析结果显示,folate-pRNA & pRNA/siRNA (survivin)二聚体与MCF-7和Hela细胞共孵育,可诱导靶细胞凋亡,凋亡率分别为32.12%±4.91 and 29.12%±2.74,显著高于单体处理组和不含folate的二聚体处理组。上述结果表明,folate-pRNA & pRNA/siRNA (survivin)二聚体纳米颗粒可靶向导入高表达folate受体的MCF-7和Hela细胞,沉默其survivin基因的表达与诱导其凋亡,为体内靶向研究提供了科学的实验依据。3.化学修饰pRNA本部分研究在成功构建folate-pRNA以及嵌合pRNA/siRNA的基础上,通过体外转录,分别引入2’-F或2’-NH2修饰的dCTP和/或dUTP,或2’-O-Me修饰的CTP和/或UTP,获得三种不同类型的化学修饰的pRNA;比较上述三种常用的化学修饰对pRNA二级结构折叠影响,自我组装二聚体活性与体外phi29 DNA包装活性影响；体外与RNA酶A (RNase A)或FBS共孵育,测定化学修饰pRNA血清学稳定性。变性及非变性聚丙烯凝胶电泳结果可见,2’-F修饰后pRNA分子大小符合预期值,且二级结构折叠正常,可形成pRNA同源或异源二聚体,提示化学修饰不影响pRNA正确折叠以及二聚体组装；体外phi29 DNA病毒包装活性检测证明2’-F pRNA活性为106 pfu/ml,较活性为107 pfu/ml的未修饰pRNA略有降低,但仍具有包装活性,且稳定性显著提高。2’-NH2修饰pRNA结果表明,2’-NH2修饰后pRNA折叠受到明显影响,进而引起pRNA包装活性明显降低或丢失；而2’-O-Me修饰pRNA实验结果表明,其2’-O-Me-UTP无法被RNA聚合酶Y639F识别,因而仅获得2’-O-Me-CTP修饰的pRNA,但活性较低。综上所述,对比三种化学修饰结果表明,2’-F修饰后pRNA稳定性同其他修饰方法类似,但其对pRNA生物学活性影响最低,可基本保留pRNA原有各项生物学活性指标,提示2’-F可作为化学修饰pRNA、提高其血清学稳定性的首选方法。4.2’-F修饰pRNA/siRNApRNA分子含分子间相互作用域和一个5’/3’双螺旋域,替换pRNA分子双螺旋结构域(5’/3’端至23/97核苷酸的序列)或者插入其他外源序列并不阻碍pRNA的折叠以及pRNA二聚体的形成,利用此特点可以对pRNA进行改造,将其作为靶向分子或效应分子。前期实验通过成功将siRNA序列引入pRNA,从而获得嵌合pRNA/siRNA分子。为进一步获得血清学稳定的pRNA/siRNA效应分子,采用体外转录,引入2’-F-dCTP和2’-F-dUTP,获得具有抗降解能力的pRNA/siRNA,即2’-氟修饰嵌合pRNA/siRNA (2’-fluoro modified chimeric pRNA/siRNA即2’-F chimieric pRNA/siRNA)。经变性与非变性聚丙烯凝胶电泳可见,2’-F chimeric pRNA/siRNA具有类似未修饰pRNA的分子大小和折叠特性,并能够与互补的pRNA单体形成二聚体复合物,条带近似未修饰pRNA二聚体分子大小,提示2’-F pRNA/siRNA能与其互补pRNA单体自我组装成二聚体纳米颗粒,pRNA/siRNA修饰成功。脂质体共转染pRNA/siRNA (GFP)和pEGFP-N1,荧光显微镜下可见实验组KB细胞内绿色荧光蛋白表达量与未修饰嵌合pRNA/siRNA (GFP)相当,且明显低于对照组,结果表明2’-F修饰不影响pRNA/siRNA基因沉默活性。体外Dicer酶切5’末端[γ-32P]标记的pRNA/siRNA(GFP),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可见其酶切后小分子条带位置大小介于19-22nt,表明2’-F pRNA/siRNA可被Dicer酶识别和酶切,释放siRNA干扰序列,进一步为其基因沉默效果提供了理论依据。与含血清细胞培养基RPMI-1640体外共孵育,结果显示2’-F修饰pRNA/siRNA可稳定存在于含血清培养基长达19h以上,而未修饰RNA则在30min内被降解。[结论]研究结果表明：①体外将folate-pRNA与嵌合pRNA/siRNA单体混合,在特定pH和5 mM Mg2+条件下可形成folate-pRNA & pRNA/siRNA二聚体,成功制备了folate-pRNA靶向的嵌合pRNA/siRNA二聚体纳米颗粒。此外,前期研究结果表明MCF-7和Hela细胞高表达folate受体,以此作为肿瘤特异性靶标,以folate-pRNA为靶向分子,pRNA/siRNA为效应分子,利用肿瘤细胞模型,研究表明folate-pRNA & pRNA/siRNA二聚体纳米颗粒能够靶向导入高表达folate受体的MCF-7和Hela细胞,沉默GFP, luciferase和survivin基因的表达,诱导GFP表达减弱,抑制萤光素酶的活性和相应细胞凋亡,为体内靶向基因沉默研究提供了实验依据；②2’-F修饰pRNA和pRNA/siRNA结果表明,2’-F pRNA和2’-F pRNA/siRNA比未修饰样品更能抵抗核酸酶降解,且其二聚体组装活性无明显变化；体外phi29 DNA病毒包装实验结果显示,2’-F pRNA具有包装活性；2’-F pRNA/siRNA基因沉默效应研究和体外Dicer酶切结果表明,其可被Dicer酶识别并释放siRNA效应分子,沉默基因表达；血清学稳定的2’-F pRNA/siRNA为进一步体内靶向沉默基因表达与效应研究奠定了基础。