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本文以玉米芯粉为碳源进行产木聚糖酶菌株的选育、发酵工艺优化、酶的分离纯化和酶学性质的研究,具体研究内容如下:
(1)利用透明圈法筛选产木聚糖酶的菌株,经鉴定该菌株LMZY为异硫链霉菌(Streptomyces althioticus)测定其生长曲线,选取26h为种子培养时间。
(2)采用单因素试验、Plackett-Burman试验设计、中心复合试验设计等方法对LMZY菌株发酵产木聚糖酶的发酵工艺进行了优化,最优培养条件为:温度40℃,周期120h,初始pH5.0,摇床转速160r/min,接种量6%,装液量50mL/250mL。最优发酵培养基配方(g/L)为:玉米芯粉24.4,大豆16,KNO38,K2HPO40.4,Na2HPO40.754,MgSO4?7H2O0.4。预测酶活为36.65U/mL,实际酶活为36.45U/mL,与预测值吻合良好。
(3)对原始菌株LMZY进行诱变,发现紫外诱变效果最佳,紫外照射最佳时间为1.0min,获得紫外诱变突变株LMZM,经摇瓶发酵测定酶活为46.61U/mL,比LMZY提高了27%左右,并且具有良好的遗传稳定性。测定其生长曲线,选取26h为种子培养时间。
(4)采用单因素试验、Plackett-Burman试验设计,中心复合试验设计等方法对LMZM菌株发酵产木聚糖酶的发酵工艺进行了优化,最优培养条件为:温度40℃、周期108h、起始pH5.5、接种量8%、摇床转速160r/min、装液量50mL/250mL。最优发酵培养基配方(g/L)为:玉米芯粉27.85,大豆粉16.25,酵母粉3.46,MgSO4?7H2O为1.176,K2HPO4为0.6,Na2HPO4为0.4。预测酶活为117.804U/m,实际酶活为116.63U/mL与预测值吻合良好,比LMZM优化前(46.32U/mL)提高了1.52倍。
(5)采用硫酸铵盐析、脱盐、离子交换层析、凝胶过滤层析色谱技术,纯化后的木聚糖酶为电泳纯单一组分,其相对分子质量为31.75kD。
(6)所得木聚酶的酶促反应最适温度为60℃,该酶最适作用pH值为8.0。研究表明:K+和Na+对该木聚糖酶酶促反应的影响不显著;Cu2+对该木聚糖酶酶促反应有较强的促进作用,其次是Ca2+、Zn2+和Mg2+;Mn2+在低浓度时作用不显著,但高浓度时抑制作用较明显;Hg2+对酶促反应的抑制作用强烈,其次是Co2+、Ba2+、Fe2+和Fe3+。同时,β-巯基乙醇和EDTA对酶促反应的影响不显著,SDS、DEPC、EDC、NBS和L-色氨酸对酶促反应有一定的抑制作用,而Triton X-100、DTT对酶促反应有一定的促进作用,尿素和L-半胱氨酸对酶促反应的促进作用更为显著。该木聚糖酶的米氏常数为43.03mg/mL,最大反应速率为312.5μmol/(mL.min)。而且,其水解产物的薄层层析色谱分析的结果表明该酶为内切木聚糖酶。此外,该木聚糖酶对底物的专一性较强,而对其他底物作用较差,且一定程度提高牛皮纸明度。
(1)利用透明圈法筛选产木聚糖酶的菌株,经鉴定该菌株LMZY为异硫链霉菌(Streptomyces althioticus)测定其生长曲线,选取26h为种子培养时间。
(2)采用单因素试验、Plackett-Burman试验设计、中心复合试验设计等方法对LMZY菌株发酵产木聚糖酶的发酵工艺进行了优化,最优培养条件为:温度40℃,周期120h,初始pH5.0,摇床转速160r/min,接种量6%,装液量50mL/250mL。最优发酵培养基配方(g/L)为:玉米芯粉24.4,大豆16,KNO38,K2HPO40.4,Na2HPO40.754,MgSO4?7H2O0.4。预测酶活为36.65U/mL,实际酶活为36.45U/mL,与预测值吻合良好。
(3)对原始菌株LMZY进行诱变,发现紫外诱变效果最佳,紫外照射最佳时间为1.0min,获得紫外诱变突变株LMZM,经摇瓶发酵测定酶活为46.61U/mL,比LMZY提高了27%左右,并且具有良好的遗传稳定性。测定其生长曲线,选取26h为种子培养时间。
(4)采用单因素试验、Plackett-Burman试验设计,中心复合试验设计等方法对LMZM菌株发酵产木聚糖酶的发酵工艺进行了优化,最优培养条件为:温度40℃、周期108h、起始pH5.5、接种量8%、摇床转速160r/min、装液量50mL/250mL。最优发酵培养基配方(g/L)为:玉米芯粉27.85,大豆粉16.25,酵母粉3.46,MgSO4?7H2O为1.176,K2HPO4为0.6,Na2HPO4为0.4。预测酶活为117.804U/m,实际酶活为116.63U/mL与预测值吻合良好,比LMZM优化前(46.32U/mL)提高了1.52倍。
(5)采用硫酸铵盐析、脱盐、离子交换层析、凝胶过滤层析色谱技术,纯化后的木聚糖酶为电泳纯单一组分,其相对分子质量为31.75kD。
(6)所得木聚酶的酶促反应最适温度为60℃,该酶最适作用pH值为8.0。研究表明:K+和Na+对该木聚糖酶酶促反应的影响不显著;Cu2+对该木聚糖酶酶促反应有较强的促进作用,其次是Ca2+、Zn2+和Mg2+;Mn2+在低浓度时作用不显著,但高浓度时抑制作用较明显;Hg2+对酶促反应的抑制作用强烈,其次是Co2+、Ba2+、Fe2+和Fe3+。同时,β-巯基乙醇和EDTA对酶促反应的影响不显著,SDS、DEPC、EDC、NBS和L-色氨酸对酶促反应有一定的抑制作用,而Triton X-100、DTT对酶促反应有一定的促进作用,尿素和L-半胱氨酸对酶促反应的促进作用更为显著。该木聚糖酶的米氏常数为43.03mg/mL,最大反应速率为312.5μmol/(mL.min)。而且,其水解产物的薄层层析色谱分析的结果表明该酶为内切木聚糖酶。此外,该木聚糖酶对底物的专一性较强,而对其他底物作用较差,且一定程度提高牛皮纸明度。