目的:研究RFC（还原叶酸载体）、GST-π（谷胱甘肽S转移酶π）、DHFR（二氢叶酸还原酶）mRNA在人骨肉瘤U2-OS细胞系及人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R₁-R₃中的表达差异,并探讨其在人骨肉瘤MTX化疗耐药中的意义。方法:采用冲击并逐步增加诱导药物浓度诱导的方法,诱导人骨肉瘤细胞系U2-OS,并建立耐MTX细胞系（U2-OS/R₁-R₃）;MTT法检测各细胞株对氨甲喋呤（MTX）,顺铂（DDP）,阿霉素（ADM）及异环磷酰胺（IFO）的药物敏感性,计算半数抑制浓度(IC₅₀)和耐药指数（RI）;利用倒置显微镜观察细胞一般形态改变,绘制生长曲线,检测细胞生长能力;利用流式细胞仪检测各细胞株细胞周期分布;利用荧光定量PCR技术在mRNA水平检测RFC、GST-π、DHFR在U2-OS及（U2-OS/R₁-R₃）中的表达。结果:本试验成功建立三株人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R₁-R₃,细胞生长曲线示耐药细胞株较原代细胞生长时间延长;流式细胞仪测细胞周期结果示耐药细胞株阻滞在G₁期,MTT法示耐药细胞株U2-OS/R₁-R₃对MTX耐药指数分别为原代的49.19、60.13、63.3倍;荧光定量PCR结果显示人骨肉瘤耐药细胞系U2-OS/R₁-R₃中RFC mRNA的表达为原代U2-OS的0.7139、0.6258、0.4908倍（组间差别有统计学意义,P＜0.05）,RFC mRNA的表达随肿瘤耐药性的增加而降低;U2-OS/R₁-R₃ DHFR mRNA的表达为原代U2-OS的5.3145、12.8937、30.6501倍（组间差别有统计学意义,P＜0.05）,DHFR mRNA随肿瘤耐药性的增加而增加;U2-OS/R₁-R₃中GST-πmRNA的表达为原代U2-OS的1.9081、3.5420、4.8319倍（组间差别有统计学意义,P＜0.05）,GST-πmRNA的表达随肿瘤耐药性的增加而增加.结论:MTX耐药与DHFRmRNA表达增加有关,与RFCmRNA的表达降低有关,与GST-πmRNA的表达增加有关。本试验在基因水平探讨人骨肉瘤细胞MTX化疗耐药机制,DHFR、GST-π基因表达的增加及RFC基因表达的降低参与了人骨肉瘤细胞的MTX耐药,为临床探索骨肉瘤患者的MTX耐药机制提供了重要的依据,为临床筛选MTX化疗不敏感患者提供重要的依据。