龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是一种广泛栽培于热带和亚热带国家、具有重要经济价值的常绿木本果树。龙眼胚胎的发育状况与其产量和品质密切相关。植物胚胎发生的中期是植物胚胎发育的一个重要阶段，植物胚胎器官的形成和胚胎储藏物质的积累程序的启动均发生在该时期。揭示龙眼胚胎发生中期的发育调控机制对龙眼生产和新品种的培育具有指导意义，但由于该时期材料获取极为困难，目前对龙眼胚胎发生中期的调控机制知之甚少。植物体胚发生与合子胚发生极为相似，植物体胚发生的研究可为揭示活体胚胎发育机制提供参考。本研究以龙眼胚性愈伤组织作为材料，进行龙眼体胚发生中期的同步化调控，并以同步化材料为基础，进行龙眼体胚发生中期的蛋白质组学研究，采用质谱技术进行部分龙眼体胚发生中期差异表达蛋白的鉴定；在质谱鉴定结果的基础上，进行龙眼体胚Ran家族基因克隆，并对其表达调控机制进行研究。此外，克隆了一个龙眼体胚Obg基因，并对其在龙眼体胚发生过程中的转录水平进行分析。本研究可为揭示龙眼及其他植物体胚发生乃至活体胚胎发生中期的分子机制提供新的线索和科学依据。本研究主要研究结果如下：1龙眼体胚发生中期的同步化调控通过往培养基(MS+20g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂，pH5.8)中添加不同浓度的2,4-D进行龙眼体胚发生中期的同步化调控。结果表明，采用附加0.06mg·L^-1和0.03mg·L^-12,4-D的培养基进行龙眼体胚发生的同步化调控，分别可获得同步化的心形胚和鱼雷形胚，同步化效率可达90%以上。研究结果表明，往培养基中添加不同浓度的2,4-D可使龙眼体胚发生同步化，不同浓度2,4-D对龙眼体胚发生的同步化调控作用可能与其对发育阶段特异性基因表达的影响有关。此外，胚性愈伤组织的状态及接种量也是影响龙眼体胚发生的同步化效果的重要因素。2龙眼体胚发生中期的蛋白质组学研究以同步化的龙眼体胚为材料，进行龙眼体胚发生中期的蛋白质组学研究。采用EttanIPGphor Ⅲ等电聚焦系统和DALTsix垂直电泳系统进行龙眼心形胚、鱼雷形胚和早期子叶形胚蛋白质的双向电泳分离。对龙眼体胚发生中期各阶段的双向电泳图谱进行分析发现：（1）随着龙眼体胚的发育，蛋白质的种类逐渐减少；（2）龙眼体胚发生中期在蛋白质组份上发生了显著的变化，其中从球形胚阶段到心形胚阶段和从鱼雷形胚阶段到早期子叶形胚阶段的变化较大，而从心形胚阶段到鱼雷形胚阶段的变化较小。这与胚胎发育过程中胚胎发育程序的转变模式一致。（3）球形胚阶段和鱼雷形胚阶段的蛋白组份有很多相似之处，这些蛋白可能与细胞分裂有关。根据龙眼体胚发生中期各阶段双向电泳图谱比对结果，选取76个差异表达蛋白点做进一步分析，这些蛋白在龙眼体胚发生中期的表达模式各异，其中10个蛋白质点已在本实验室龙眼体胚发生早期和成熟过程的蛋白质组学研究中成功鉴定，对其余的66个蛋白质点进行质谱分析，成功鉴定35个蛋白质点。对成功鉴定的蛋白进行功能注释，结果显示：（1）18个蛋白具有催化活性；（2）15个（33%）蛋白的功能未知；（3）51%的蛋白参与代谢途径，包括酒精代谢、氮化合物代谢、分解代谢、合成代谢、色素代谢，大分子代谢、细胞代谢、初级代谢以及氧化还原，表明龙眼体胚发生中期代谢变化活跃；（4）7个蛋白与氧化胁迫有关，进一步证明了氧化胁迫在龙眼体胚发生过程中的重要性；（5）4个蛋白点被鉴定为角蛋白，一般情况下认为该类蛋白存在于动物中，而植物中并不存在；（6）两个小G蛋白的表达在龙眼体胚发生中期发生活跃变化，表明其在龙眼体胚发生中期具有重要作用。3龙眼体胚Ran家族基因的克隆、生物信息学分析及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析（1）在龙眼体胚发生中期蛋白质组学研究的基础上，进行龙眼体胚Ran家族基因的克隆：①共获得龙眼体胚Ran家族基因cDNA序列31条：DlRan3A-1-DlRan3A-14(JF461272-JF461282, JQ775532, JQ775533, JQ861699；DlRan3B-1-DlRan3B-9（HM773390,JF461283-JF461288, JQ775530, JQ775531），DlRan3C-1-DlRan3C-3（JF461289-JF461291）；DlRan3D-1-DlRan3D-2（JF461292, JF461293）， DlRan3E-1（JF461294）， DlRan3F-1（JQ775527），DlRan3G-1（JQ775528）。根据开放阅读框序列的特异性可将这些cDNA序列分为9种类型，共编码7个龙眼体胚Ran蛋白，7个蛋白的氨基酸序列高度相似，相似性达98.27%。Ran家族基因不同转录本间存在同义密码子使用的差异，使得具有不同核苷酸序列的Ran转录本可编码同一个蛋白质。研究结果表明不同同义密码子的使用可影响mRNA二级结构。②本研究还得到带有完整ORF的Ran家族基因DNA序列2条（DlRan3A和DlRan3B）。对Ran家族基因cDNA序列和DNA序列进行比对分析，发现31条cDNA序列中仅有部分序列与目前得到的2条Ran家族基因DNA序列一致，而其余cDNA序列可分为2种类型，第一种类型cDNA的序列前半部分的序列和DlRan3B的序列一致，而后半部分的序列与DlRan3A的序列一致；而第二种类型cDNA的序列正好相反，前半部分的序列和DlRan3A的序列一致，而后半部分的序列与DlRan3B的序列一致；这表明龙眼Ran家族基因可能还存在其他成员。③对龙眼体胚Ran家族基因转录本的5’UTR和3’UTR进行分析，发现：○a龙眼体胚Ran家族基因的转录存在转录起始位点多态性；○b龙眼体胚Ran家族基因转录本存在3’UTR长度的多态性。转录起始位点和3’UTR长度的多态性可能与龙眼体胚Ran的表达调控有关。此外，还获得了4条带有提前终止密码子的Ran家族基因cDNA5’末端。（2）根据生物信息学分析结果，龙眼体胚Ran基因编码的7个Ran蛋白分别定位于细胞核、细胞质和叶绿体。龙眼体胚Ran蛋白的磷酸化位点、功能基序、保守结构域、蛋白二级结构和三维结构基本相似。同源性分析结果表明，龙眼体胚Ran蛋白与其他植物Ran蛋白高度同源，一致性高于90%；与动物等物种Ran也有很高的同源性。这表明龙眼体胚Ran可能与其他物种的Ran具有相似的功能。（3）根据31条龙眼体胚Ran cDNA序列推导的氨基酸序列第10位的氨基酸残基将这些序列分为N和D两类。采用LightCycler480进行龙眼体胚发生过程中N类和D类龙眼体胚Ran转录水平的qPCR分析，结果表明，两种类型Ran基因的转录水平变化模式基本一致，在龙眼体胚发生早期维持在较高的水平，球形胚阶段两类Ran的表达量均急剧下降，心形胚阶段上升到最高水平，然后逐渐下降，早期子叶形胚阶段的表达量最低，成熟胚阶段的表达量再度上升，但是仍维持在较低的水平。Ran在活跃增殖的组织中高表达，这与其在细胞周期进程中的功能一致。将龙眼体胚发生过程中Ran的转录水平变化情况与其蛋白质表达变化趋势进行比较，发现二者并不完全一致，可能是受转录后调控影响的结果。4龙眼体胚发生过程中Ran表达调控研究（1）本研究从龙眼胚性培养物中分离得到PTC-Ran cDNA共5条：DLRan、DlRan-4、DlRan-5、DlRan-6和DlRan-7。将5条PTC-Ran cDNA序列和对应的正常转录本DlRan3B-4的序列与Ran基因DNA序列进行比对分析，发现这5条PTC-Ran cDNA的序列均与DlRan3B的序列一致，这些序列可能由DlRan3B的mRNA前体通过可变剪接（alternative splicing）产生。将这些PTC-Ran cDNA和对应的正常转录本DlRan3B-4的可能剪接模式进行比对分析，发现这些cDNA中的PTC（premature termination codon,提前终止密码子）可能是由于内含子驻留引起的。对5条PTC-Ran cDNA中PTC的位置进行分析，发现这些PTC的位置符合NMD（nonsense-mediated mRNA decay,无义降解）识别条件，这些转录本有可能为NMD降解对象。为了验证这些转录本为NMD降解对象的可能性，分析了放线菌酮对PTC-Ran转录本表达量的影响。RT-PCR检测表明，龙眼胚性愈伤组织中也有DLRan的表达，然而DLRan2和DLRan3在龙眼胚性愈伤组织中不表达。采用放线菌酮处理龙眼胚性愈伤组织，可显著提高龙眼胚性愈伤组织中DLRan的表达量，这表明DLRan可能为NMD降解对象。DLRan2和DLRan3在放线菌酮处理的龙眼胚性愈伤组织中也不表达，表明PTC-Ran的表达可能存在阶段特异性。采用qPCR对DLRan、DLRan2和DLRan3在龙眼胚性愈伤组织、球形胚和早期子叶形胚阶段的相对表达量进行分析，结果表明DLRan在龙眼体胚发生过程中差异表达，DLRan2和DLRan3在龙眼胚性愈伤组织、球形胚和鱼雷形胚阶段均不表达。对DLRan与对应正常转录本DlRan3B-4在龙眼胚性愈伤组织、球形胚和鱼雷形胚阶段的总转录水平进行分析，发现二者的总转录水平变化趋势与DLRan的变化趋势一致。DlRan在龙眼胚性愈伤组织、球形胚和鱼雷形胚阶段的规律性表达，表明PTC-Ran转录本的产生可能具有生物学意义，我们推测PTC-Ran转录本的产生可能与龙眼体胚Ran转录后水平的精确调节有关。（2）采用本实验室建立的龙眼体胚miRNA数据库，进行龙眼体胚Ran3’UTR miRNA结合位点的预测。结果表明，长的龙眼体胚Ran3’UTR拥有更多的潜在miRNA结合位点。分析了不同长度龙眼体胚发生过程中Ran3’UTR表达情况，发现龙眼体胚Ran3’UTR受发育调控但未随体胚发育延伸。推测龙眼体胚Ran可能与细胞分裂有关，3’UTR可能与龙眼体胚发生过程中Ran表达调控有关。5龙眼体胚Obg1基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析本研究克隆得到龙眼体胚Obg1基因（DLObg1）的cDNA序列3条。序列分析表明，DLOBG1蛋白具有典型的OBG蛋白结构域，与其他植物的OBG蛋白具有较高的同源性，与葡萄、蓖麻和玉米的氨基酸序列一致性分别为84%、84%和82%。实时荧光定量PCR分析显示，DLObg1的转录水平随龙眼体胚的发育而变化，在心形胚和鱼雷形胚阶段的表达量最高，推测其可能与子叶等器官的形成有关。综上所述，本研究通过龙眼体胚发生中期的同步化调控研究，获得了高度同步化的心形胚和鱼雷形胚阶段的龙眼体胚。以同步化材料为基础，分析了龙眼体胚发生中期蛋白质组的变化情况，成功鉴定了35个差异表达蛋白质点。以质谱数据为基础，克隆得到31条龙眼体胚Ran家族基因cDNA序列，并进一步分析了龙眼体胚发生过程中Ran的表达情况。分离得到多条PTC-Ran cDNA序列。研究了PTC-Ran转录本及3’UTR与龙眼体胚Ran表达调控的关系。此外，还克隆了龙眼体胚Obg1基因，并分析了龙眼体胚发生过程中Obg1基因的表达情况。为揭示龙眼和其他植物体胚发生甚至活体胚胎发生中期的分子机制以及Ran的表达调控机制提供参考。