论文部分内容阅读
前言关节软骨缺损是一种常见的损伤，由于软骨的自我修复能力极弱，一旦受损将导致坏死，发生骨性关节炎。胰岛素样生长因-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是在软骨发育和软骨自稳态调节中最重要的生长因子之一，IGF-1能刺激软骨细胞分裂增殖，并促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖来维持软骨细胞表型，故其可能作为软骨缺损治疗的有效药物。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有以下特点：①易于获取，来源稳定，可来源于自体和异体成人骨髓穿刺，从成人的脂肪和滑膜中也可获取；②传代能力强，表型稳定；③多向分化，在体内不同微环境和不同诱导因子的作用下可分化成为软骨、骨骼、神经、肌腱和肌肉组织等。近来在诸多领域，尤其是作为组织工程的种子细胞受到重视，若将转基因技术与千细胞技术相结合构建新型种子细胞无疑非常具有意义。材料和方法一、实验动物日本大耳白兔4只，雌雄不限，月龄1今月，体重0.5-1.0kg，由中国医科大学实验动物中心提供。二、主要仪器及试剂1、主要仪器恒温CO2培养箱（Thermo公司）；超净工作台（月坛双入水平层流型，北京半导体元件厂）；倒置显微镜（Olympus IX70型，日本Olympus公司）；高速恒温冷冻离心机（Sigma，1K-15）；旋涡震荡器（美国VORTEX-2GENE）；小型台式离心机（美国Sigma1-13）；电泳仪（美国BIO-RAD PowerPac2000）；垂直板电泳装置（美国BIO-RAD Mini-ProteinⅢ）；荧光显微镜（日本Olympus AX70型）；半干转印仪（美国BIO-RAD Semidry Transfer System）。2、、主要试剂T4DNA连接酶、DH5a、RNaseA、pcDNA3-GFP（图1）和含有IGF-1cDNA全长的质粒pcDNA3．1-IGF-1（图2）由吉林大学徐莘香教授惠赠；DMEM培养液购自美国Gibco公司；标准胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶为Sigma公司；Percoll分离液为Pharmacia公司；CD14和CD45抗体来自于三塔生物技术有限公司；CD29抗体来自于Chemicon；CD44抗体来自于BIOSOURCE（Camarillo，CA）；转染试剂LipofectamineTM2000，为美国Invitrogen公司；IGF-1单克隆抗体来自BD生物技术有限公司；ColⅡ单克隆抗体来自于三塔生物技术有限公司；聚偏氟乙烯膜（PVDF）、滤纸等购于BIO-RAD公司；ECL（enhanced chemilluminent reagent）试剂盒购于Pierce公司。3、实验方法（1）兔骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学活性观察①兔骨髓间充质干细胞的培养用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增。②流式细胞仪检测取P1代细胞，用流式细胞仪进行分析、鉴定。③生物学性状的观察用倒置显微镜每日观察细胞的生长情况并拍照。绘制P1、P3、P5代细胞生长曲线。（2）胰岛素样生长因子-1及绿色荧光蛋白双载体的构建①质粒pcDNA3．1-IGF-1的扩增及纯化。②pcDNA3．1-IGF-1质粒的鉴定。③构建pcGI重组质粒。④pcGI重组质粒的鉴定。（3）胰岛素样生长因子-1基因修饰对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响①脂质体介导IGF-1基因转染MSCs及鉴定。②观察转染后的MSCs，计算转染效率。③Western blot检测IGF-1、ColⅡ蛋白表达，采用SPSS10.0统计分析软件对所得比值进行方差分析。实验结果一、兔MSCs的分离、培养和传代成功1、细胞悬液接种于塑料培养瓶后，细胞大多为圆形单核细胞，散在均匀分布，接种第7天，细胞贴壁融合率达80％-85％，部分融合成片状，呈旋涡状生长。传代后的细胞生长速度加快，大多于传代后12小时内贴壁、伸展，为长梭形细胞，生长潜伏期较短，7-10天后长满瓶底，增殖生长迅速。各代细胞形态基本一致，都为长梭形。2、经流式细胞仪检测，培养细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，CD14和CD45表达阴性。3、绘制P1、P3、P5代次细胞生长曲线后，通过分析可以看出，随着传代次数的增加，细胞的增殖能力变化不大。二、成功构建了含有GFP和IGF-1基因的真核表达载体1、质粒pcDNA3．1-IGF-1的扩增及纯化成功。2、真核表达载体的酶切鉴定证实pcDNA3．1-IGF-1内含有IGF-1cDNA片段。3、pcDNA3．1-IGF-1内插入的IGF-1cDNA片段序列与文献报道的结果一致。4、pcGI真核表达载体的酶切鉴定表明所构建的质粒方向及大小正确。三、经IGF-1基因修饰的MSCs能够稳定表达Ⅱ型胶原蛋白1、脂质体介导IGF-1基因转染MSCs后，荧光显微镜下观察，转染成功的细胞可激发出绿色荧光。2、转染后24小时基因转染效率约为（30±2.5）％。3、Western blot测定IGF-1表达和Ⅱ型胶原（CollagenⅡ）蛋白表达净灰度值转染组明显高于空载体组和未转染组。结论1、密度梯度离心法与贴壁培养筛选法相结合体外培养兔骨髓间充质干细胞，可以提高干细胞分离纯化效率，使体外培养的骨髓间充质干细胞增殖能力增强，从而进一步证明了骨髓间充质干细胞可以作为组织工程中理想的种子细胞。2、成功构建了含有GFP和IGF-1基因的真核表达载体。3、经IGF-1基因修饰的MSCs表达IGF-1增加，能够稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。