论文部分内容阅读
背景:手术、化疗放疗等传统手段很难遏制进展期胃癌的复发、转移,而肿瘤干细胞的存在可能是胃癌复发转移的主要因素之一。目前尚无靶向肿瘤干细胞的治疗方法。已知转录因子OCT4和SOX2在肿瘤干细胞的形成和保持肿瘤干细胞特性和功能方面起到重要作用,因此干扰这些基因抑制肿瘤干细胞的影响值得探索。目的:探讨SOX2和OCT4的基因干扰对人胃癌干细胞的增殖的影响。从新的角度提出针对肿瘤干细胞治疗的方法,为开辟胃癌治疗的新途径奠定理论和实验基础。方法:1.应用RT-PCR的方法检测人胃癌细胞(BGC-823)中转录因子SOX2和OCT4的表达。2.化疗药物处理并富集胃癌细胞中的干细胞。3.流式细胞术检测化疗药物处理前后胃癌干细胞表面标记CD44+的比例。4.设计、合成siRNA-sox2和siRNA-oct4,设siRNA-SOX2组(转染siRNA-SOX2),siRNA-OCT4组(转染siRNA-OCT4),共转染组(共转染siRNA-SOX2和siRNA-OCT4)组,空白对照组(只加入转染试剂,无siRNA)以及正常对照组并转染化疗药物处理前的胃癌细胞及处理后并富集的胃癌干细胞。通过RT-PCR技术在mRNA水平验证RNA干扰的效果。5.流式细胞术检测化疗药物处理前后RNA干扰转录因子SOX2和OCT4对胃癌细胞周期变化的影响。6.MTT法测化疗药物处理前后RNA干扰转录因子SOX2和OCT4对胃癌细胞增殖的影响。结果:1.胃癌细胞BGC-823中存在转录因子SOX2和OCT4的表达。2.化疗药物5-FU处理胃癌细胞后,绝大部分细胞死亡,存活率为7±0.202%;细胞周期中G0/G1期细胞较处理前显著升高(89.76%±4.93% VS 68.19%±2.92%,P<0.01),S期细胞较处理前显著降低(0% VS 23.94%±1.98%,P<0.01),存活细胞中干细胞标志物CD44+的比例较处理前显著升高( 10.14±0.192% VS 0.74±0.052%,P<0.01)。5-FU处理后转录因子SOX2表达较处理前显著升高(25±0.41% VS 8±0.3%, P<0.01);转录因子OCT4的表达较处理前亦显著升高(83±4.7% VS 20±2.1%,P<0.01)。说明化疗药物5-FU处理后残留的胃癌细胞中富含胃癌干细胞。3.siRNA-sox2和siRNA-oct4转染胃癌细胞后, SOX2表达比例由干扰前8±0.3%下降至1±0.2%,P<0.01。OCT4表达比例由干扰前25±2.1%下降至2±0.4%。4.siRNA干扰胃癌细胞转录因子后siRNA-SOX2组、siRNA-OCT4组、共转染组组与空白组比较M/G2期细胞比例均显著降低(P<0.01),干扰组之间无明显差异,各干扰组S期细胞比例均比正常组显著升高(P<0.05),干扰组之间无明显差异。5.siRNA干扰胃癌细胞系BGC-823转录因子SOX2和OCT4后,siRNA-SOX2组,siRNA-OCT4组,共转染组与空白对照组(只转染脂质体,无特异性siRNA)相比其细胞增殖均明显减慢,高峰期延迟P<0.01,各RNA干扰组之间无统计学差异。siRNA干扰后应用化疗药物5-FU,干扰各组与对照组相比细胞对化疗药的敏感性显著增强(P<O.O1),各干扰组无差异。siRNA干扰5-FU处理后胃癌细胞后siRNA-SOX2组,siRNA-OCT4组,共转染组分别与对照组相比增殖显著抑制,P<0.01。结论:1.人低分化胃癌细胞系BGC-823表达干细胞相关转录因子SOX2和OCT4。2.化疗药处理胃癌细胞后胃癌干细胞比例显著升高,可以达到富集肿瘤干细胞的目的。3.化疗药物处理前,RNA干扰目的基因可以使胃癌细胞的增殖减慢,高峰期延迟,而使其对5-FU敏感性显著上升。化疗药物处理后,RNA干扰可显著抑制肿瘤干细胞富集的胃癌细胞增殖,比持续给予化疗药物的抑瘤效果更加显著。提示化疗药物与RNA干扰联合治疗可以增强抗肿瘤治疗的疗效。目的转录因子SOX2和OCT4在维持肿瘤干细胞增殖的过程中起到重要作用,是未来肿瘤干细胞治疗的潜在靶点之一,通过RNA干扰技术干扰干细胞相关基因可能成为未来治疗肿瘤的新策略。